质粒DNA的提取纯化及验证

1、质粒dnA勺提取、纯化及验证姓名：肖风 学号：2010001001222010 级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用， 掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。2、掌握质粒DNA勺纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。3、学习并掌握凝胶电泳进行 DNA勺分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电 泳方法及凝胶中DNA勺分离纯化方法。二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA勺方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、 羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化饨密度梯度离心法和 Wizard法等。其中，碱变 性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA勺提取。该

2、方法操作简单，易于 操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA屯度高，可直接用于酶切、序列测 定及分析。 碱变性提取质粒DNA-股包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增 质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNAiZ共价闭合环状形式存 在。细胞破碎后，染色体DNAW质粒DNA匀被释放出来，但是两者变性与复性所 依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12. 0的碱性溶液中，染色体DNA勺氢键断 裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA勺大部分氢键断裂，但两条 互补链不完全分离。当用pH值4. 6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶

3、液至中 性时，变性的质粒DNAM恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中； 但染色体DNM能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质一 SD必合物等一 起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的 质粒DN"离。溶于上活液的质粒DNA可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形 成沉淀。由于DNM RNA性质类似，乙醇沉淀DNA勺同时，也伴随着RNAK淀， 可利用RNase A将RNA奉解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白， 可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极

4、广。此外，凝胶中 DN司勺位置可以用低浓度荧光插入染料如漠化乙锭 (EB)或SYBRGold染色直接观 察到，甚至含量少至20 Pg的双链DN雌紫外激发下也能直接检测到。需要的话， 这些分离的DN软带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能 灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖 凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对分子质量，分离经限制酶 水解的DN"段，进一步纯化DN酣。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷， 在电场中向正极移动。DN

5、M琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：(1)样品DN冶子的大小：电泳时，线性双螺旋DN"子是以头尾位向前迁 移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子 有更大的摩擦阻力。DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNAH程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结 构的质粒 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA , oeDNA分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状 DNA(1iner

6、DNA L DNA)子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下， 超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。(3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的 DNAt段 在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。 通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越 人,DN如泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。 电泳所用电场：低电压条件下，线性DNAt段的迁移速率与所用电压 成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离 DNA勺有效范围随着电压上升而减少。为了获得DN"段的最佳分离效果，

7、电场强度应小于 5 V/cm当电泳液为去离(5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。子水（如不慎误用去离子水配制凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢， DNM乎不移动；而在高离子强度下（如错用10X电泳缓冲液），导电性极高，带 电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DN姓性。（6）温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DN舶段的相对电泳迁移率在4 30C内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0. 5%时，凝胶很脆弱，最好在4C下电泳以增加凝胶强度。三、【实验材料】恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴锅；1.5mL离心管，50mL离心管，

8、不同型号的吸头，微量移液器等。菌体：E.coli DH5 a受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯， Eppendorf管，刀片，塑料薄膜等。酶切后的DNA羊品或其他待分离纯化的DNA羊品；琼脂糖，TAE缓冲液，漠化乙 锭（EB, 6X上样缓冲液，DN目对分子质量标准物 DNA Marker入/Hind III , 5 mol/L pH5.2 的醋酸钠，无水乙醇。四、【实验步骤】（一）、实验前准备1、LB培养液+1%S萄糖按照附录所示配方配制LB培养液，并添加1%葡萄糖，115C灭菌30min, 分别分装于100mL锥形瓶中

9、20mL 300mL锥形瓶中50mL同时配制固体培养基 用于活化菌株。2、枪尖：1000 L （蓝色）、200 L （黄色）、20 L （白色），灭菌备用3、离心管：1.5mL离心管于500mL锥形瓶中，50mL心管2支，灭菌备用4、吸管：10mL吸管，灭菌备用（二）、质粒提取1、细胞培养在含有氨节宵霉素的LB平板上挑去携带有质粒pUC19的E.coli单菌落，接种 于20mL含氨节宵霉素的LB液体培养基中，37C振荡培养过夜。将过夜培养液吸 取2-3mL接种到50mL含有氨节宵霉素的LB培养基中,37C培养4-6h,即到 达菌体生长的对数晚期。2、质粒提取2.1. 取30mL菌液于50mL灭

10、菌离心管中，在7000r/min条件下离心5min, 弃去上活液，收集菌体细胞。空管质量为 15.570g。2.2. 向离心管中加入5mL冰箱预冷的溶液I,加入溶液I主要是为了打散菌体，使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬:液，为下一步破碎菌体做准备，可剧烈振荡，此时细胞尚未破裂，不用担心染色体断裂。为节省时间，可在漩涡振荡仪上 混匀。通过步骤(1)离心，弃去上活液，将离心管倒置，使上活液全部流尽， 用吸水纸擦十，称量菌体质量，为 15.742-15.570=0.172g。2.3. 按湿菌体质量：溶液I体积=100mg 1mL的比例加入用冰箱预冷的溶液I (2ml)，剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管

11、置于碎冰中冰浴5min2.4. 以2倍体积加入新配制的溶液U (4ml)，轻摇轻加，至半透明溶液形 成。此步是DN姓性的关键步骤，加入溶液II后，菌悬:液pH上升到12左右， 为强碱性，破坏大肠杆菌(G-)细胞壁，此时，溶液变粘稠、透明，无菌块残留， 因为染色体DNM质粒DNA匀变性溶解于强碱溶液中，蛋白质也溶于溶液中，但 质粒DNA®链不完全分离。因此步染色体DN醉放，故动作必须轻柔，不能剧烈 震荡，否则染色体DN怂断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解于溶液中，与质粒 DNA昆合在一起，不利于质粒DNA纯。可缓慢上下颠倒离心管数次，既要使试 剂与染色体DNA分作用，乂不破坏染色体的结构

12、。2.5. 以1.5倍溶液I体积量加入冰箱预冷的溶液m (3ml),轻加轻摇，慢 慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上 10min,此时有白色絮状沉淀物。此步是质粒DNA®性的关键步骤。动作要轻柔， 理由同上。同时可减少对质粒 DNA勺破坏，使其保持超螺旋闭环结构。2.6. 12000r/min离心15min,将上活液轻轻转移到另一洁净离心管中， 向上活液中加入1/10体积的3mol/mL的NaAc和2倍体积的冰无水乙醇，混匀，-20 C下静置30min,沉淀DNA2.7. 如(6)中离心15min,小心弃去上活液，将离心管倒置于纸巾上, 以使所有的液体

13、流出。2.8. 向沉淀物中加入70S醇3mL不打散沉淀洗涤一遍。12000r/min 离心5min,弃去上活液，将离心管倒置于纸巾上，室温十燥。2.9. 将DNA淀溶于ImLTE冲液中，加入RNase A （终浓度大于50 g/mL）。37 C 保温 0.5 1h。3质粒DNA勺纯化3.1. 将上述DNA容液平分在2个1.5mL的微量离心管中，每管0.5mL,分 别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层活液 到另一洁净微量离心管中。离心后，苯酚位于离心管的最下方，蛋白质层位于中 间，溶解有质粒DNA勺水层位于最上方。离心管从离心机里取出后，尽量减少晃 动

14、，以免蛋白层污染DNAK溶液，使分界面模糊、不活晰，不利于下一步分离。使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时，一定要戴橡胶手套，注意安全。一旦皮肤被苯酚等污染，立即用大量水活洗。3.2. 加入等体积苯酚：氯仿（1:1 ）混合液，混匀，7000r/min离心5min, 取上层活液到另一洁净微量离心管中。3.3. 加入等体积氯仿溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层水相到另 一洁净微量离心管中。3.4. 加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc溶液，混合均 匀,于-20C沉淀0.5h以上。沉淀质粒DN柯采用无水乙醇，需在低温条件下静 置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类，

15、低温条件可保证DNAK解酶类保持在 低活性，以减少其对DNA勺降解。用70%勺乙醇洗涤质粒DNAK淀，主要目的是 利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入 RNaseA前洗涤去盐类，可保证 BW舌不受其影响。3.5. 12000r/min离心15min,收集沉淀，弃去上活液并十燥。3.6. 在沉淀 DNA中，加入 70S醇200 L,不打散沉淀洗涤一次， 12000r/min离心1min,小心弃去上活液，将离心管倒置于纸巾上使所有的液体 流出，室温十燥。3.7. 用50 L TE溶液重新溶解DNA温和震荡几秒钟，备用。溶解沉淀 时，为获得最大量产品，应逐滴加入溶剂，边加边摇；尽量少转动离心管

16、，避免 过多样品粘于壁上导致损失。4 DNA纯度检测（0.9%琼脂糖凝胶电泳法）4.1. 制板4.1.1. 称量0.36g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 40mL 1X TAE缓冲液，在 微波炉中加热，使琼脂糖融化。4.1.2. 待凝胶温度降至大约55 C以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握 得住）04.1.3. 在模具上插入一个合适的梳子形成加样孔（如果待回收的DNA积较大时，可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住，使之形成较大的孔）。梳齿的位置应在托盘底面上0.51.00mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加 样孔。4.1.4. 将凝胶倒入准备好的制胶模具中，等凝胶完全冷却凝固后变成乳白 色

17、不透明状（月30min）,将梳子轻轻拔出。4.1.5. 用拇指和食指轻移胶版两侧，将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。4.2. 电泳4.2.1. 取3 L质粒样品+1 L电泳载样液，在塑料薄膜上用微量移液管吹吸混匀，加入到凝胶孔中，枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。吹洗法混匀少量液体时需注意避免产生气泡，增加操作难度和误差。用微量移液器吸进液体时应该小心，避免产生气泡；吹出液体时，不要将液体从针尖口完全吹出， 要留一滴在针尖口处，可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解，不至于损失。注意，在塑料薄膜上混匀buff

18、er 和DNA羊品时，枪尖不要太倾斜，以免吹走液滴。4.2.2. 取适量上样缓冲液和一定量的待分离纯化的DNA羊品（如酶切产物、PCFT物等）滴在塑料薄膜上，混合均匀后一同加入到凝胶孔中，样品应沉于孔底（混合液比重大）。此外，在相邻的加样孔中加入合适的 DNAMarker （如入/Hind III 3L）。4.2.3. 点样完成后，盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳压（一般是5V/cm）以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA羊品从负极向正极移动。4.2.4. 当前沿DN服近胶的前端时，切断电源，停止电泳(大约1h, 100V, 打开槽盖。4.2.5. 用漠化乙锭染色10min后，用凝胶成像仪观察，记录结果。六