赤芍总苷提取纯化与质量检查设计方案

1、赤芍总昔的提取纯化与质量检查设计方案文献背景赤芍为毛豆科植物芍药.或川赤芍的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药甘、芍药内酯甘、氧化芍药甘、苯甲酰芍药 甘、芍药花甘等单菇甘类化合物，总称赤芍总甘，可改善机体微循环，抑制血小 板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活性口，是一种可用于保健食品的中药。 1.1赤芍总昔背景意义在药理学上，赤芍总甘对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循 环的作用。并且赤芍总甘对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用口，正是这样的良好使用疗效，我们需要对赤芍总昔进行更多的研究， 来保证临床的使用疗 效。提取研究现状目前报道的赤芍总甘提取工艺文献中

2、，多采用正交试验设计法口。即分别称取赤芍药材若干（通常），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表 试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。纯化研究现状目前报道的赤芍总昔纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附 法口。即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸 储水至药材的倍量，作为待纯化样品溶液。纯化方法（正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液，取等量石油醴萃取次， 除去石油醴层，然后用水饱和后的正丁醇萃取次， 收集正丁醇层，再用蒸储水洗 次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。纯化方法（大孔树脂吸附法）：大孔吸附树脂，

3、经乙醇浸泡，充分溶胀后装 柱，蒸储水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液取，上树脂柱，倍量蒸储水 洗，再用倍量的乙醇洗脱，收集洗脱组分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥 器中干燥。质量控制赤芍中赤芍总昔质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色 斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为，理论板数按芍药甘峰计算应不低于）以及水分、炽灼残渣，重金属等检测。赤芍饮片的质量检查性状：本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕 和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红 色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。鉴别：取本品粉末，加乙

4、醇，振摇分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解， 作为供试品溶液。另取芍药昔对照品，加乙醇制成每含的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法（附录VI）试验，吸取上述两种溶液各 分别点于同一硅胶薄层 板上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（：）为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相 应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。含量测定：照高效液相色谱法（通则）测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以甲醇磷酸二氢钾溶液（：）为流动相; 检测波长为。理论板数按芍药甘峰计算应不低于。对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥小时的

5、芍药昔对照品适量，精密称定，加 甲醇制成每含的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粗粉约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，称定重量，浸 泡小时，超声处理分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤 过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 注入液相色谱仪，测定，即得。 本品含芍药甘（）不得少于。参考文献：版中国药典赤芍总昔的提取工艺指标成分的选择及含量测定赤芍中所含丰富的甘类成分总称赤芍总甘， 为赤芍的主要活性部位，其中以 芍药甘的含量最高，选择芍药甘作为含量测定的指标成分。色谱条件的优化选择色谱柱的选择：考察（*。和（* ）流动相选择：流动相考察甲醇水系

6、统、甲醇磷酸溶液系统、乙月青水及乙月青磷 酸溶液系统。流速选择：流速考察、对照品溶液的制备精密称取芍药昔对照品，置量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得 对照品贮备液（每含芍药甘对照品。标准曲线的制备分别精密量取对照品贮备液溶液（山置容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同浓度对照品溶液各 以注入液相色谱仪，按前述色谱 条件分别测定其峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制 标准曲线。供试品溶液的制备及测定取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品 溶液与供试品溶液各 内注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药甘 含量。提取溶媒的筛选

7、：赤芍中所含甘类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。 本 实验以芍药甘的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药甘的提取效 率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。见表：表不同提取溶媒芍药昔含量乙醇提取溶媒水乙醇溶媒用量（倍）提取次数（次）提取时间（）芍药昔含量（）正交试验设计优化提取工艺因素水平设置溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数 等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为个考察因素，因素水平 设置见表。表因素水平表因素水平提取溶媒（倍）提取时间（）提取次数（次）实验安排及结果考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水平，

8、 选取正交表（）作正交试验，所选因素一水平见表。称取川赤芍药材约，按 （）正交 试验表按排试验，以芍药甘含量（芍药昔含量提取液中芍药音质量称取的药材量 *）为评价指标。试验方案见表表（）正交试验表表头芍药昔含量列号验证试验以优化工艺条件重复试验次，验证试验结果见表表验证试验结果试验 试验号投料量 固形物固形物芍药甘 芍药甘力杀()得率平均得率含量平均含量() () ()() () ()赤芍总昔（）的纯化工艺的优化上样液预处理赤芍醇提液减压浓缩至无醇味，加水适量分散溶解、过滤定容，制成每毫升 含生药（）的溶液，备用。大孔吸附树脂型号筛选取型和型大孔吸附树脂各，装于树脂柱中（径高比为），取样液上样

9、。先用蒸 储水，再用 乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，测定，结果见表。从芍药音吸附解析 率和残液中芍药昔含量综合考虑，选择树脂种类。表树脂动态吸附实验结果残液中含量 树脂型号（）（）（）上样浓度考察取 型大孔吸附树脂份，每份，装柱（径高比为），分别取含生药浓度为 、 、样品液上样，吸附流速为。然后用水洗脱，再以乙醇洗脱,按色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药昔含量，结果见表。表上样浓度考察结果上样浓度（）芍药甘洗脱量（）洗脱率（）泄漏曲线考察取 型大孔吸附树脂，装于树脂柱中（径高比），取样品液上样，吸附流速为 收集流出液，每为一流分。按如下色谱条件测定，绘制泄漏曲线，确定最大上样 量。色谱条件：色谱柱（X

10、以匕月青为流动相，水为流动相，按表进行梯度洗脱； 流速；柱温C；检测波长。表流动相梯度洗脱时间表时间流动相流动相吸附流速的考察取 型大孔吸附树脂份，每份，装柱（径高比为），取样液上样，吸附流速分别 为、。进行动态吸附后，先用水洗脱，再用 乙醇洗脱，按色谱条件进 行测定，结果见表表吸附流速考察结果吸附流速（）芍药甘洗脱量（）洗脱率（）树脂径高比考察取直径依次为、的树脂柱根，分别加入 型大孔吸附树脂各，装柱（径高比 为、），取样液上样，吸附流速为。然后用水洗脱，再以 乙醇洗脱，收集乙 醇洗脱液，按色谱条件进行测定，结果见表。表树脂径高比考察结果树脂径高比芍药甘洗脱量（）洗脱率（）水洗除杂体积考察取

11、 型大孔吸附树脂四份，每份，装柱（径高比），取样品液上样，吸附流速分 别为，进行动态吸附后，分别用、和水洗，测定水洗脱液中芍药昔的含量， 计算损失率，结果见表。表水洗除杂体积考察结果水洗脱体积（）水洗液中芍药甘累积含量（）芍药昔累积损失率（）洗脱溶剂考察取 型大孔吸附树脂份，每份，装于树脂柱中（径高比为：），样品液上样，吸 附流速分别为- 0然后先以水洗脱，再分别用、和乙醇洗脱，按色谱条件进行 测定醇洗脱液中芍药昔含量，结果见表。表洗脱溶剂考察结果洗脱剂乙醇（）芍药甘洗脱量（）洗脱率（）洗脱曲线取 型大孔吸附树脂，装于树脂柱中（径高比为），样品液上样，吸附流速分别 为。然后先以水洗脱，再用乙醇

12、洗脱，每收集一份，洗脱液减压至干，以甲醇 复溶，按色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药昔含量， 绘制洗脱曲线，确定洗脱剂 用量。赤芍中赤芍昔提取物的质量控制性状：棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。鉴别：取本品粉末，加乙醇，振摇分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解， 作为供试品溶液。另取芍药昔对照品，加乙醇制成每含的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法（通则）试验，吸取上述两种溶液各 内分别点于同一硅胶薄层板 上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（：）为展开剂，展开，取出，晾干，喷 以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应 的位置上，显相同的蓝紫色斑点。含量测定：照高效液相色

13、谱法（通则）测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇磷酸二氢钾溶液（）为流动相； 检测波长为。理论板数按芍药甘峰计算应不低于。对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥小时的芍药昔对照品适量，精密称定，加 甲醇制成每含的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，称定重量，浸 泡小时，超声处理分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤 过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 片注入液相色谱仪，测定，即得C 将提取物中芍药昔含量换算成药材中芍药昔含量， 对比药典，检查提取纯化工艺 是否合适。版中国药典中规定

14、赤芍药材中含芍药甘（）不得少于。系统适用性试验线性关系考察 吸取上述对照品溶液、，分别置量瓶内，加甲醇稀释至刻 度，摇匀，分别精密吸取 N注入液相色谱仪分析。以进样量（。为横坐标，峰 面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果见表：表线性关系考察结果芍药昔对照品（）峰面积精密度试验 精密量取已知浓度的芍药昔对照品溶液 内按液相色谱条件，进样 测定次，结果见表：表精密度试验结果峰面积值平均值（）稳定性试验 取本品，制备供试品溶液，测定芍药甘于小时内峰面积,结果见表：表稳定性试验结果时间（小时）峰面积值平均峰面积值（）重复性试验 取本品，一式份，制备供试品溶液，测定样品中芍药昔含量，结果见表：

15、表重复性试验结果样品量（）芍药昔含量（）平均含量（）（）加样回收率试验 取已知含量芍药甘的本品份，每份约，精密称定，分别按样品 中芍药昔含量精密加入芍药昔对照品，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，精密量取续滤液 内经分析，测定芍药昔含量，计算回收率，结果见表：表加样回收率试验结果取样量（） 样品中芍芍药昔对芍药昔测回收率（） 平均回收（）药昔量（）照品加入得量（）率量（）水分按中国药典年版四部通则的第二法项下操作，取本品粉末约，平铺于恒 重的扁形称量瓶中，厚度,精密称定，打开瓶盖C,烘小时，盖好，移至干 燥器中冷却分钟，精密称定，同样温度下在烘小时移至干燥器中冷却分钟，精密称定。直至连续两次

16、称定重量之差（为止。 按减失重量和称样量计算供试样品中 水分含量（）见表。表水分含量样品编号水分含量平均含量5.5炽灼残渣按中国药典年版四部通则进行炽灼残渣的检测，取本品粉末约，置已炽 灼至恒重的培竭中，精密称定，缓缓织灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸使湿 润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在C炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷 至室温，精密称定后，再在c炽灼至包重。表炽灼残渣样品编号炽灼残渣平均值重金属检查取本品，按中国药典年版四部通则重金属检查法二法炽灼破坏， 检查 批 样品，并同时做空白试验，标准管含 。表重金属限量重金属限量工艺流程赤芍药材()根据药典方法检查药材质量乙醇加热回流提取,设计正交试验确定最佳提取工艺参数提取药材，得到提取液减压浓缩，回收乙醇浓缩液加水溶解，过滤定容药液采用单因素试验筛选纯化工艺参数确定最佳纯化工艺参数最佳工艺醇洗脱液I减压浓缩赤芍总昔I对赤芍总昔进行质量检查7实验进度及安排日期实验进度安排月日药材薄层鉴别药材含量测定 提取工艺试验试验月日纯化工艺月日赤芍昔薄层鉴别赤芍昔含量测定 参考文献：阮金兰，赵钟