11_DNA重组技术的基本工具(用）

1、1.1 1.1 DNADNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具基因工程产品抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)定向基因改造设想 那么，什么是基因工程呢？那么，什么是基因工程呢？一、基因工程的概念一、基因工程的概念 是指按照人们的愿望，进行严格的是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外设计，通过体外DNADNA重组技术重组技术和和转基因技转基因技术术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合符合人们需要的生物类型和生物产品人们需要的生物类型和生物产品，由，由于基因工程是在于基因工程是在DNAD

2、NA分子水平上分子水平上进行设计进行设计和施工的，因此又叫和施工的，因此又叫DNADNA重组技术重组技术；也叫；也叫基因拼接技术基因拼接技术。基因工程概念的分析基因工程概念的分析 (1)DNA的的基本组成单位都是四种基本组成单位都是四种（ ）(2) DNA分子的空间结构都是分子的空间结构都是( )(1)DNA的的基本组成单位都是基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。四种脱氧核苷酸。(2) 双链双链DNA分子的空间结构分子的空间结构都是规则的双螺都是规则的双螺旋结构。旋结构。(3)生物界生物界共用一套共用一套( )（基因工程中需要哪些基本工具呢（基因工程中需要哪些基本工具呢?）脱氧核苷酸脱氧核苷酸规则

3、的双螺旋结构。规则的双螺旋结构。遗传密码遗传密码 2外源基因在受体内外源基因在受体内表达表达的理论基础的理论基础1基因基因拼接拼接的理论基础的理论基础基因工程诞生的基因工程诞生的理论基础理论基础 二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀”-“分子缝合针分子缝合针”-“分子运输车分子运输车”-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶载体载体1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀” （1 1）来源：）来源： 主要是主要是原核生物原核生物；（2 2）种类：）种类：（3 3）作用：）作用：（4 4）结果：）结果：约约400

4、04000种；种；识别识别双链双链DNADNA分子分子的某种的某种特定的核苷酸特定的核苷酸序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键（切点）磷酸二酯键（切点）断断开。开。( (6 6个个, ,4 4、5 5、8 8个个) )形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线中心轴线处切开时，产生的是处切开时，产生的是平末端平末端。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，产生的是切开时，产生的是黏性末端黏性末端。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoR

5、IEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切限制酶的切割割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。1、种类：、种类：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶 2 2、 DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针

6、”类型2、作用部位：、作用部位：磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA聚合酶DNA连接酶区别区别相同点相同点形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链将将DNADNA双链上的双链上的两个两个缺口同时连接缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板（2）.载体的作用：载体的作用： a、和外源基因结合，并将其转移到受体细胞中去。、和外源基因结合，并将其转移到受体细胞中去。 b、利用运载体在受体细胞内对外源基因进行大量、利用运载体在受体细胞内对外源基因进行大量复制。复制。（1）.常用的载体有：常用的载体有： 人工改造的人工改造的质粒，

7、动植物病毒，质粒，动植物病毒， 噬菌体的衍生物等噬菌体的衍生物等3 3、载体载体“分子运输车分子运输车”最常用的质粒是大肠杆菌的质最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有粒，其中常含有标记基因标记基因，如，如四环素的抗性基因、氨苄青霉四环素的抗性基因、氨苄青霉素的抗性基因、荧光蛋白基因素的抗性基因、荧光蛋白基因等，供重组等，供重组DNA的的筛选筛选和和鉴定鉴定。质粒是质粒是一种裸露的、结构简单、独一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，）之外，并且具有并且具有自我复制自我复制能力的能力的双双链链环环状状DNADNA分子。分子。质粒是基因工程质粒是

8、基因工程最常用最常用的载体。的载体。(3).作为运载体必须具备的条件作为运载体必须具备的条件1.能够在受体细胞中能够在受体细胞中自我复制自我复制并并稳定稳定地保存。地保存。2.具有具有一个或多个限制酶切点一个或多个限制酶切点，以便与外源基，以便与外源基因连接。因连接。3.具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行筛选。，便于进行筛选。4.必需是安全的，不会对受体细胞有害。必需是安全的，不会对受体细胞有害。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的

9、是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外 源DNA D限制酶只存在于原核生物中课堂巩固2、DNA连接酶催化的反应是( )ADNA复制时母链与子链之间形成氢键 B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接 DA、B、C都不正确CC3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是( )A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选A4、质粒是基因工程最常见的载体，它的主要特点是( )能自主复制

10、不能自主复制结构很小 是蛋白质是环状RNA是环状DNA能“友好”地“借居”A、 B、 C DC5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为( )A、目的基因上有标记 B、质粒具有某些标记基因C、重组质粒能够复制 D以上都不正确B6、关于质粒的叙述正确的是( )A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子 B、质粒是唯一的载体C、重组质粒是目的基因 D、质粒可在宿主外单独复制A7、下列黏性未端属于同一限制酶切割而成的是( )A、 B、 C、 D、 B8.8. 已知标记基因有已知标记基因有抗四环素基因抗四环素基因和和抗氨苄青霉素的基因抗氨苄青霉素的基因, ,现探讨现探讨某细菌的质粒某细菌的质粒中中有无标记基因

11、有无标记基因或标记基因是什么或标记基因是什么, ,请设计实验、预期实验结果，并请设计实验、预期实验结果，并写出相应的实验结论写出相应的实验结论对照组：对照组：不添加抗不添加抗生素生素实验组实验组1 1：添加一定浓添加一定浓度的四环素度的四环素实验组实验组2 2：添加一定浓添加一定浓度的氨苄青度的氨苄青霉素霉素实验组实验组3 3：添加添加一定浓度的四一定浓度的四环素和氨苄青环素和氨苄青霉素霉素对照组对照组实验组实验组1 1实验组实验组2 2实验组实验组3 3 结结 论论预期一预期一+ + + + +预期二预期二+ + +预期三预期三+ + +预期四预期四+ +既含有抗四环素基因也含既含有抗四环素

12、基因也含有抗氨苄青霉素基因有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因不含有抗氨苄青霉素基因限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制，限制性内切酶性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。在质粒上有。在质粒上有酶酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1）请画出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出