基因工程的原理和技术62754PPT学习教案

1、会计学1基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术62754 遗传效应是指能转录为遗传效应是指能转录为mRNA，继而翻译为蛋，继而翻译为蛋白质，或转录为核糖体白质，或转录为核糖体RNA、转运、转运RNA的功能。的功能。什么是遗传效什么是遗传效应？应？第1页/共60页蛋白质蛋白质DNA基因基因线性排列线性排列脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸基脱氧核糖含氮碱基磷酸基脱氧核糖含氮碱基遗传物质遗传物质的主要载的主要载体体（DNADNA的基本单位的基本单位）基因、基因、DNA、染色体、脱氧核苷酸的关系、染色体、脱氧核苷酸的关系第2页/共60页RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点编码区：能转录为相应的编码区：能转录为

2、相应的mRNA进而指导蛋白质的进而指导蛋白质的 合成。合成。 非编码区：不能转录为相应的非编码区：不能转录为相应的mRNA但有调控遗传但有调控遗传 信息表达的核苷酸序列，位于编码区的信息表达的核苷酸序列，位于编码区的 上游和下游。上游和下游。第3页/共60页区分：启动子与起始密码区分：启动子与起始密码 终止子与终止密码终止子与终止密码起始密码起始密码终止密码终止密码启动启动子子终止子终止子ATC基因基因转录区转录区TAA转录转录ATC转录转录起始点起始点翻译翻译起始点起始点转录转录终止点终止点RNA起点起点RNA终点终点第4页/共60页RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子

3、信使信使RNA成熟的信使成熟的信使RNA第5页/共60页第6页/共60页第7页/共60页为什么要有这一步为什么要有这一步第8页/共60页主要是指主要是指的基因，例如的基因，例如，与生物与生物抗逆性抗逆性相关的基因相关的基因、与与优良品质、生物药物优良品质、生物药物和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基因因等等，也可以是一些具有，也可以是一些具有的因子。的因子。第9页/共60页第10页/共60页 第11页/共60页第12页/共60页文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中有无启动子基因中有无启动子基因中有无内含子基因

4、中有无内含子基因多少基因多少物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无无无有有有有可以可以部分基因可以部分基因可以某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因第13页/共60页n就像从图书馆借一本书，要知道书名、作者、出版社或人物情节等信息一样n获取目的基因前，要对这个基因的背景有一定程度的了解，（如核苷酸序列、基因的功能、位置以及基因的表达产物的特性等）然后通过恰当的技术手段将目的基因从基因文库中调取出来。第14页/共60页获取目的基因方法：获取目的基因方法：利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因全称是：全称是：应应，在生物，在生物复制复制的核酸合成技术

5、。可以在短时间内大量扩增的目的基因。的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。第15页/共60页 DNA DNA复制的过程涉及复制的过程涉及。通常将。通常将DNADNA的羟基的羟基（-OH-OH）末端称为）末端称为，而磷酸基团的末端称为，而磷酸基团的末端称为5端端3端端3端端5端端第16页/共60页3端端5端端5端端3端端第17页/共60页DNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNA，只能从，只能从3 3端延伸端延伸DNADNA链。因此，链。因此，DNADNA复制需要复制需要。当引物与。当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，

6、DNADNA聚合酶就能从聚合酶就能从引物的引物的3 3端开始延伸端开始延伸DNADNA链。链。DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的端向端向端延端延伸伸3535353535353535第18页/共60页DNA复制的过程复制的过程1.1.解旋解旋: :利用细胞提供的能量边利用细胞提供的能量边解旋、边复制解旋、边复制2.2.配对配对: :分别以每条单链为模分别以每条单链为模板板, ,以四种游离的脱氧核以四种游离的脱氧核苷酸为原料苷酸为原料, ,利用碱基互利用碱基互补配对原则合成两条新补配对原则合成两条新的子链的子链3.3.螺旋：两条子链分别与对应螺旋：两条子链分别与对应的模板链绕

7、成螺旋型，的模板链绕成螺旋型，构成两个新的构成两个新的DNADNA分子分子第19页/共60页思考：思考： DNA复制需要哪些成分和反应条件？复制需要哪些成分和反应条件？ 如何在体外设置一个类似的如何在体外设置一个类似的DNA复制环境？复制环境？参与的组分参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶打开打开DNA双链双链DNA母链（模板链）母链（模板链）提供提供DNA复制的模板复制的模板4种脱氧核糖核苷酸种脱氧核糖核苷酸合成子链的原料合成子链的原料DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA子链子链引物引物使使DNA聚合酶能够从聚合酶能够从3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸第20

8、页/共60页 DNADNA双链复制的原理双链复制的原理（遵循（遵循原则）原则） 含待扩增目的基因片段的含待扩增目的基因片段的； 根据目的基因双链各一端序列片段合成根据目的基因双链各一端序列片段合成 与两条模板链相结合的与两条模板链相结合的； 要有要有； 四种单核苷酸（四种单核苷酸（）。）。DNADNA热变性的原理热变性的原理前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列第21页/共60页55-60：加热至：加热至， DNA片段片段受热后受热后断裂，形成断裂，形成：冷却至冷却至，引物结合到互补，引物结合到互补DNA链链；：加热至：加热至，耐热的耐热的从引从引物起

9、始引导互补链的合成物起始引导互补链的合成。目的基因以目的基因以方式扩增，即方式扩增，即第22页/共60页获取目的基因方法获取目的基因方法DNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成第23页/共60页为什么要有这一步为什么要有这一步第24页/共60页第25页/共60页目的基因目的基因标记基因 第26页/共60页质粒质粒DNADNA分子分子两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种同种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端 为什么不能将目的基因直为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？接导入受体细胞？通过通过cDNAcDNA文

10、库获得的目的文库获得的目的基因有启动子和终止子吗基因有启动子和终止子吗？ 在构建表达载体（重组在构建表达载体（重组DNADNA分子）过程中需要分子）过程中需要什么分子工具？什么分子工具？ 只考虑两两结合，可产生只考虑两两结合，可产生几种重组几种重组DNADNA分子？分子？第27页/共60页为什么要有这一步为什么要有这一步第28页/共60页目的基因进入受体细胞内，并在受目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为体细胞中维持稳定和表达的过程，称为动植物细胞和动植物细胞和、枯草杆菌、枯草杆菌、酵母菌等微生物。酵母菌等微生物。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途

11、径。第29页/共60页v 农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染染植物和植物和植物，受植物体伤口处的细植物，受植物体伤口处的细胞分泌的胞分泌的大量大量的吸引，农杆菌中的的吸引，农杆菌中的上的上的可转移至受体细胞，并整合到受体可转移至受体细胞，并整合到受体细胞细胞上。上。1 1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞a.农杆菌转化法（采用最多的方法农杆菌转化法（采用最多的方法）v 原理：将原理：将插入到插入到，通过农杆菌转，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞上。使

12、目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。v 优点及应用：此法比较经济和有效，约优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是的转基因植物都是通过这种方法获得。通过这种方法获得。第30页/共60页v 我国科学家独创的一种方法我国科学家独创的一种方法v 实例：实例：我国的我国的v （1）常用于常用于的基因的基因转化转化 v （2）缺点：缺点：基因枪基因枪法法花粉管通道法花粉管通道法第31页/共60页2 2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞提纯基因表达载提纯基因表达载体体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵经胚胎早期培养后经胚胎

13、早期培养后移植到雌性体内移植到雌性体内受体细胞：受体细胞：显微注射技显微注射技术术基本操作程序基本操作程序：受精卵受精卵最常用的方法最常用的方法:第32页/共60页第33页/共60页思考思考4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗?n有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的.第34页/共60页1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（

14、最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理处理花粉管通道法花粉管通道法第35页/共60页为什么要有这一步为什么要有这一步第36页/共60页第37页/共60页第38页/共60页第39页/共60页是一小段单链是一小段单链DNADNA或者或者RNARNA片段（片段（约约2020到到500bp500bp），用于检测与其互补的核酸序列。），用于检测与其互补的核酸序列。根据重组质粒上目的基因的部分根据重组质粒上目的基因的部分DNADNA序列，人工合序列，人工合成（或成（或PCRPCR技术合成）与之互补的一小段单链技术合成）与之互补的一小段单链DNAD

15、NA（或（或RNA) ,RNA) ,利用带有利用带有32P-32P-磷酸的磷酸的dATPdATP使其标记上放射性同位素，这一使其标记上放射性同位素，这一小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNADNA探针探针。 互补碱基互补碱基序列的序列的DNADNA分子，可以通过碱基对分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。之间形成氢键等，形成稳定的双链区。DNADNA分子杂交的双方是所使用的分子杂交的双方是所使用的和和DNADNA分子杂交的理论基础是：分子杂交的理论基础是：第40页/共60页基因探针与目的基因杂交，观察标记有无基因探针与目的基因

16、杂交，观察标记有无杂交带杂交带第41页/共60页将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与的核的核酸进行酸进行杂交杂交第42页/共60页第43页/共60页分子分子水平水平检测检测第44页/共60页第45页/共60页以上检测是以上检测是水平，有时还需进行水平，有时还需进行水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。特性的鉴定等。第46页/共60页是否赋予个体新的遗传特性是否赋予个体新的遗传特性分子分子水平水平检测检测第47页/共60页基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、形成重组、形成重组DNADNA分子；分子；3 3、

17、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞、 目的基因表达目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、抗原分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定第48页/共60页第49页/共60页将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体将目的基因插人土壤农

18、杆菌的质粒，构建表达载体，通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转，通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株。化的香蕉细胞通过组织培养形成植株。生态安全问题包括：生态安全问题包括： 外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植物残体或分泌物对环境的影响。转基因植物残体或分泌物对环境的影响。如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能

19、力提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）第50页/共60页成熟的编码蛋白成熟的编码蛋白的的mRNAmRNA分子分子加入逆转录酶，反转录加入逆转录酶，反转录mRNAmRNA，合成一条与其互，合成一条与其互补的补的DNADNA单链分子单链分子在在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，以第一条以第一条DNADNA单链为模单链为模板合成第二条单链板合成第二条单链第51页/共60页第52页/共60页RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点非编码区非编码区编码区编

20、码区非编码区非编码区外显子外显子外显子外显子内含子内含子内含子内含子外显子外显子AB BC CD DE E真核生物基因的结构真核生物基因的结构A AB BC CD DE EA AC CE E加工加工翻译翻译初级初级RNARNAmRNAmRNA蛋白质（多肽）蛋白质（多肽）基因控制蛋白质的合成基因控制蛋白质的合成转录转录第53页/共60页所谓所谓是指一种全体的集合是指一种全体的集合则是指某一生物全部基因的集则是指某一生物全部基因的集合。合。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是的主要途径。的主要途径。对于复杂的染色体对于复