姜黄素抑制单核细胞浸润并减少单核细胞来源GRN分泌抗肝纤维化的机制研究

1、姜黄素抑制单核细胞浸润并减少单核细胞来源GRN分泌抗肝纤维化的机制研究第一部分单核细胞分泌GRNS化HSC促进肝纤维化机制研究目的：肝纤维化(liver fibrosis) 是多种慢性肝病进展的共同病理过程 , 是我国严重的公共卫生 问题。近年来研究表明巨噬细胞 , 特别是单核细胞来源的巨噬细胞可以促进肝纤 维化, 但其机制仍不清楚。最新研究显示巨噬细胞可以分泌颗粒体蛋白 (granulin,GRN) 促进纤维化。本 研究旨在揭示巨噬细胞及GRr促进肝纤维化的机制，为肝纤维化的治疗寻求新的 靶点。方法：首先我们检测了 121例慢性肝病患者CLD肝脏中GRN表达,分析GRN 与肝脏炎症、纤维化、

2、临床肝病指标的关系 , 以及在不同原因肝病患者中的表达 差异；然后,我们通过腹腔反复注射CC14和胆管结扎的方式建立小鼠肝纤维化模 型,检测不同纤维化模型小鼠不同时期肝脏中GRN表达变化；利用GRN-/-小鼠建立肝纤维化模型,探索GRN寸肝纤维化的作用；利用GRN与肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs) 系-LX-2共培养,通过q-PCR检测平滑肌肌动蛋白a 2(smooth muscle act in alpha 2,ACTa 2)和 I 型胶原 a 1(collage n type I alpha l,Coll a 1)等指标,观察GRN寸HSCs舌化的影响,

3、通过 WB检测ERK1/2 P-38、 JNK AKT和NF-k B等蛋白表达和磷酸化水平,探索GRN舌化HSC0勺机制；利用 GRNW巨噬细胞表面分子CD68 F4/80和CD11b荧光共染,观察在肝纤维化期肝 脏中GRN表达来源;利用脂质体尾静脉注射去除掉小鼠肝巨噬细胞,观察去除掉巨噬细胞后小鼠肝脏中GRNg达；利用野生型小鼠和GRN-/-小鼠的骨髓单核细胞 和肝脏原代HSCs共培养,观察单核细胞来源的巨噬细胞对小鼠肝星状细胞的活 化作用。结果：在CLD患者肝脏中GRN表达较普通人明显升高,且与肝脏炎症呈正 相关, 不同病因之间无明显差异。与CLD患者肝脏临床指标相关性分析发现,肝组织内中

4、GRN细胞数量与谷丙转氨酶 (alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶 (aspartateaminotransferase,AST) 、谷氨酰转肽酶 (glutamyl transpeptidase,GGT) 、总胆 红素(total bilirubin,Tbill)、Child-Pugh评分呈正相关,与白蛋白水平无明显的相关性。在CC14腹腔反复注射和胆管结扎这两种小鼠肝纤维化模型中，GRN表达随着CC14腹腔注射次数增加和胆管结扎时间延长明显增加。在CC14腹腔反复注射建立小鼠肝纤维化模型中，与野生型小鼠相比，GRN-/-小鼠肝脏中a -SMA和Col-1表

5、达明显减轻，炎症因子白介素(interleukin,IL)-4 和IL-10降低。GRNf LX-2共培养后,LX-2表达ACTa 2和Coll a l明显增加， 而且ERK1/2和STAT3磷酸化水平明显增加。在CLD患者肝组织免疫荧光中,GRN与 CD68共染较普通人明显增多。在普通 小鼠肝脏中GRN主要与F4/80荧光共染，而纤维化小鼠模型中GRN与CD11b共染 明显增多。相比于普通人CLD患者肝组织切片显示，CD68+细胞数量明显升高。肝纤维化 小鼠模型中，F4/80+和CD11b细胞数量也较空白对照组明显升高。与野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠骨髓单核细胞来源的巨噬细胞活化 HSC

6、s作 用明显减轻。结论：肝纤维化过程中，GRN表达明显升高，与肝脏炎症和纤维化密 切相关。拮抗GRN乍用后,HSCs活化减轻和肝纤维化缓解。而GRN舌化HSCS的作用， 与ERK1/2和STAT3磷酸化有关。肝纤维化过程中，GRN主要由单核细胞来源的巨噬细胞分泌。单核细胞来源 的巨噬细胞可以通过分泌 GRN促进HSCs活化,加重肝纤维化。第二部分姜黄素抑制单核细胞浸润减轻肝纤维化的机制研究目的 : 既往研究 发现姜黄素具有良好的抗肝纤维化作用 ,但其作用机制尚不清楚。近年来有研究 显示姜黄素具有抑制趋化因子分泌和单核细胞浸润的作用。在本研究中 , 我们旨在研究姜黄素是否可以通过抑制库普弗细胞

7、(Kupffer cells,KCs) 活化来减少趋化因子的分泌 , 从而抑制 Ly6Chi 单核细胞浸润以及 Ly6Chi 单核细胞相关的促纤维化细胞因子分泌来缓解肝纤维化。 方法:24 只小鼠 被随机分为三组：空白组、CC14组和姜黄素组。其中CC14组和姜黄素组予以CC14腹腔注射,每周两次,连续四周。空白组小 鼠相应予以橄榄油腹腔注射。CMC-NA溶液重悬姜黄素。姜黄素组小鼠每日予以姜黄素灌胃，连续四周，空白组和CC14组予以相应体积的CMC-NA溶液灌胃。结果： 姜黄素给药后 , 纤维化模型小鼠肝脏炎症和纤维化明显减少。与 CCl4 组比较,姜黄素组小鼠Ly6Chi单核细胞的肝内浸润明显减少，但其他白细胞亚型 无差异。姜黄素显著降低 Ly6Chi 单核细胞相关促炎性和促纤维化细胞因子分泌 ,与 肝内 Ly6Chi 单核细胞数量减少相一致。进一步的研究发现姜黄素能够降低 KCs 活化和肝内单核细胞趋化因子分泌 ,这解释了姜黄素为什么可以减少肝纤维化过 程中的 Ly6Chi 单核细胞浸润。细胞实验中我们发现姜黄素抑制巨噬细胞向 M1型的极化，减少单核细胞趋化因子MCP-1和CCL7的分泌。这与姜黄素抑制ERK1/2和p38通路蛋白磷酸化有 关。结论：综