造血干细胞的提取

1、造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞(hematopoietic stem cells , HSG)是指具有自我更新 和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个 细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时乂具图1造血系统和造血干细胞分化图4K PCFUfaCFD-GCFUhM9 州15 Gf 路:WrpcxfirTl Lyir<liE iProaonilorCFU< i I !*CFU-B4i CFU- CAFC； GEMMI有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化 的能力。Stem CellsE

2、arl Progenttor Cell*Prageniltor Cel lsMature Cslk7T-LmptiDcylu&anulocyl f p 1& nuiocyia* Crwjtrpphilft WcncwM耳M TlTflffl&QcylwiEryirmyttiiFig。 1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.造血干细胞主要存在丁骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外 周血相比，脐血来源丰富、受病蠹污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造 血干细胞具有更高的增

3、殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫 排斥活性，是优良的造血干细胞来源。造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜仑田胞集落形成单位(colony - forming unit-granulocyte/ macrophage, CFU-GM )、 红系爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroid , BFU-E )、巨核细胞集落 形成单位(colony-forming unit-megakaryocyte, CFU-MK )、红系-粒系-巨嗜系- 单核系集落形成单位(multipotent colony-forming unit

4、s , CFU-GEMM 或 mixed colony-forming unit , CFU-Mix )，等等，它是在半固体培养基上培养 14天，然 后在显微镜下计数集落。造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同,CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1 +、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为 是造血干细胞的标志。此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是 AC133, 但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。一、实验原理1、用流式细胞仪分析细胞表型SchamaDc tit Um camefier rslrumen

5、l待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光 染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进 入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下， 细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形 成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流 和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流 的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一 起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相 交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排 列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受 到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射 光信号，同时被

6、荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子 信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来， 结合多参数分析, 从而实现了细胞的定量分析。2、单个核细胞的分离采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。3、CD34细胞分选利用抗原抗体反应的原理，样品中的CD34钿胞可与偶联有CD34ft原的磁珠反 应，将MiniMACS免疫磁性吸附柱置丁磁场中，未与磁珠结合的 CD34细胞随 缓冲液流出，与磁珠结合的CD3弁细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后 用MAC家冲液冲洗吸附柱即获得纯化的 CD3分细胞。4、集落检测利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某

7、一系的细胞 分化，从而在半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个 造血干/祖细胞。二、实验材料脐血脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求身体健康，发育良好的 非高龄产妇。无遗传病史，无病蠹病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方 病。HIV、肝炎、梅蠹等检测均为阴性。健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌 采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌 ACD B25mL抗凝剂（每100mLACD B 含有：一水合枸椽酸0.48g,二水合枸椽酸钠1.32g, 一水合葡萄糖1.47g）,相 当丁 100mL的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血 50-100mL。采集后脐带血置 丁 4C冰箱内保存，一般

8、在6小时内取回分离。培养基与细胞因子培养基为IMDM培养基，添加20%的胎牛血活。细胞因子均为人重组蛋 白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6 （IL-6）和白细胞介素-3 （IL-3 ）、粒细 胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细 胞生成素（EPO）、三、实验方法单个核细胞的Ficoll密度梯度离心分离将脐血用IMDM培养基以1: 2稀释，在50mL离心管中加入15mL Ficoll, 之后小心加入30mL稀释的脐血平铺在Ficoll上，之后置丁吊篮式离心机中在 400g下密度梯度离心30min,吸取中间的白层，用IMDM培养基洗涤细胞， 除去淋

9、巴细胞分离液和血小板。集落分析方法CFU-GM的检测体系为IMDM培养基，添加20%胎牛血活，4mmol/mL 谷氨酰胺，含0.9%甲基纤维素，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6,GM CSF、G-CSF其浓度分别为 50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL 和20ng/mL。半固体培养在24孔板中进行，每孔加半固体培养基500卜L ,加入 2.5X 104个单个核细胞。在37C、5%CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培 养14天后在显微镜下进行集落计数，超过 50个细胞的细胞簇为一个集落。流式细胞分析取1.0 X 106细胞用PBS洗两遍，重悬后分

10、配到1.5mL管中离心，加PE偶 联的小鼠抗人CD34单抗和FITC偶联的小鼠抗人CD45单抗各10PL, 4C孵 育30分钟。PBS洗两遍，离心后，每管加1mL FACS保存液。同型对照以PE 偶联的小鼠抗真菌蠹素标记。标记细胞用流式细胞仪（ BD公司）分析，结果 用Lysis II软件处理，以CD45设门进行分析。脐血CD34细胞的分离纯化将1.0X 108细胞悬:浮丁 0.3mlMACS缓冲液中，加50卜l偶联丁磁珠的小 鼠抗人CD34+抗体，4C孵育30分钟，采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离 装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34

11、 +细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34 +细胞。四、实验结果1、单个核细胞的分离脐血的体积脐血中单个核 细胞液体积分离出的单个核细胞液的密度分离出的单个核 细胞液的体积收率样品12.5 妇07个/ml40ml样品21.25 x107个/ml40ml2、造血干/祖细胞集落计数孔内接种的单个核细胞数目孔内的集落数每10000个细胞中集落的数目一袋脐血中总集落数样品12.5 X10443样品22.5 M04313、脐血中CD3星田胞的数量CD34+ffl胞的比例一袋脐血中CD34+细胞的总数样品1样品24、脐血中分离得到的CD348胞的数量CD34+

12、ffl胞的数目样品1样品2五、讨论1、从一袋血获得的CD34+田胞数与集落形成数之间有和关联？2、用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离法获得的 CD34+田胞数，与流式细胞分析的结果是否一致？若不一致，原因何在？动物细胞培养、计数、冷冻和复苏I.动物细胞的培养和计数一、实验目的由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和 体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理 想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。 另外，目

13、前方兴未艾的组织工程、 十细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是 细胞工程、组织工程等研究领域的基础。本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数 板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。二、基本原理动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境， 在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结 构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或 组织进行实效培养的过程，

14、这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养 10-50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无 限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞 两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可 在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。动物细胞培养与微生物培养有很大不同,这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基 酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血

15、活；对于培养环境的适应性也比微 生物差，其对环境极其敏感，包括 pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物 有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时 间较长，它们对环境的影响乂比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和 氮气的混合气体进行供氧和调节 pH。动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病蠹或细胞均可导致动 物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器也以及 环境都有可能含有污染物。因为动物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养 时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随 时取样

16、进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计 数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2,点样后其厚度为0.1mm,这样每个方格的体积即为1.0X 10-4ml,细胞数的计算公式为：四个大方格总细胞数X稀释倍数x 104-4,单位是细胞数ZmLo细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的 细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整， 细胞被染上蓝色，存活率为：活细胞数+总细胞数X 100%。三、仪器、材料和试剂1. 超净工作台2. 倒置显微镜3. 二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为 5%。4. 培养基: DMEM

17、培养基，除菌过滤；自制无血活培养基，0.22回 滤膜除菌过滤。5. 血活：Hyclone新生小牛血活。6. PBS缓冲液，0.22网滤膜除菌过滤7. 胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25%, 0.22四滤膜除菌过滤。8. 玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121C湿热灭菌，30分钟。9. 血球计数板10. 移液枪11. 台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用四、实验步骤1. 贴附型细胞传代培养(1) 倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基；(2) 用10ml无菌PBS洗涤，倒掉；(3) 加入2ml胰酶溶液(0.25%),进行消化；(4) 显微镜下观察，直至所有细胞由铺展

18、状态收缩为圆球形；(5) 倒掉胰酶；(6) 按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。2. 悬浮细胞传代培养按贴附型细胞传代培养步骤(6)操作即可。3. 细胞计数(1) 将十净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙；(2) 待计数样品如果需要，用PBS进行稀释；(3) 取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液(0.4%),用滴管 轻轻吹打混合；(4) 用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平台上完全充满细胞悬浮液，(5) 显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度；五、注意事项1. 胰酶消化的程度必须掌握好，消化

19、不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损；2. 在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮 液溢出平台，同时不能出现气泡；3. 对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含 25- 50个细胞为合适；4. 对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的 细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计 入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方 格内还是小半在方格内。六、实验记录记录四个大方格内各自的活细胞数和死细胞数， 并最终计算样品的 细胞密度。七、思考题1. 传代培养过程中导致污染的原因有哪些

20、？2. 引起细胞计数误差的原因有哪些？II.细胞的冷冻和复苏一、实验目的细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的， 它们常常会发生各种变异，表 现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往 会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。因此， 在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来， 以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内 具有结构和功能的稳定性和一致性。本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方 法。二、基本原理在动物细胞的组成成分中90%以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶， 由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要 维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用 的冷冻保护剂有二甲基业碉（DMSO）和甘油，其中二甲基业碉因为其对细胞 具有良好的保护性和较低的蠹副作用二成为首选。在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下 降速率，实际操作中二甲基业碉的浓度通常为510%, 一股来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏