淀粉酶的固定化生产

1、微生物发酵工程实验微生物发酵工程实验中南民族大学工商学院中南民族大学工商学院环境与生物工程实验教学中心环境与生物工程实验教学中心1实验四、淀粉酶的固定化生产实验四、淀粉酶的固定化生产 一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、实验步骤五、实验结果六、注意事项 七、思考题2 学习细胞固定化的原理，通过海藻酸学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的酵母，掌握菌体包埋钠包埋固定产淀粉酶的酵母，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。的应用。一、实验目的一、实验目的3细胞固定化技术：细胞固定化技术： 固定化细胞就是被限制自由的细胞。即采

2、用固定化细胞就是被限制自由的细胞。即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。反复或连续使用。二、实验原理二、实验原理游离细胞游离细胞 固定化细胞固定化细胞4 最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。为多数微生物代谢的产物与其生长相关。 微生物在固定化后以其生长状态可分为微生物在固定化后以其生长状态可分为3类：类： 固定化死细胞；固定化死细胞； 固定化活细胞（休眠状态）；固定化活细胞（休

3、眠状态）； 固定化增殖细胞（生长状态）。固定化增殖细胞（生长状态）。5微生物细胞的固定化方法有：微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法，）吸附法， （2）包埋法，）包埋法， （3）不用载体法。）不用载体法。 包埋法包埋法67 本实验采用本实验采用凝胶包埋的固定化方法凝胶包埋的固定化方法，把，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。8三、实验材料三、实验材料1. 酵母菌细胞：酵母菌细胞：面包酵母。面包酵母。2.培

4、养基：培养基： 发酵培养基：发酵培养基：葡萄糖：葡萄糖：4%4%；蛋白胨：；蛋白胨：1%1%；磷酸二氢钾：；磷酸二氢钾：0.5%0.5%；七水硫酸镁：；七水硫酸镁：0.2%0.2%酵母膏：酵母膏：0.5%0.5%，pHpH：5.5-6.55.5-6.5。 固定化培养基：固定化培养基：淀粉：淀粉：2 2；葡萄糖：；葡萄糖：0.5%0.5%；蛋白胨：；蛋白胨：1%1%；磷酸二氢钾：；磷酸二氢钾：0.5%0.5%；七水硫酸镁：；七水硫酸镁：0.2%0.2%；酵母膏：；酵母膏：0.5%0.5%，pHpH：5.5-6.55.5-6.5。 3. 3. 海藻酸钠溶液及交联剂海藻酸钠溶液及交联剂CaClCaC

5、l2 2溶液。溶液。 9四、实验步骤四、实验步骤（一）培养基灭菌（一）培养基灭菌 取取250ml250ml三角瓶，分别放入配好的液体培养基三角瓶，分别放入配好的液体培养基 100ml100ml，灭菌冷却。，灭菌冷却。（二）种子活化和接种（二）种子活化和接种 酵母菌接入培养基，酵母菌接入培养基，25培养活化，取活化后的培养活化，取活化后的酵母菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混酵母菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混匀。匀。10（三）培养（三）培养 将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min200r/min，2525培养，离心收获菌体

6、并用无菌水洗涤一培养，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次，制备菌悬液，使其中酵母菌数为数量级次，制备菌悬液，使其中酵母菌数为数量级10107 7个个/ml/ml。（四）（四）海藻酸钠及交联剂的制备海藻酸钠及交联剂的制备 海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1.5g1.5g，2.0g2.0g，2.5g2.5g，3.0g3.0g，3.5g3.5g，分别置于，分别置于250ml250ml三角瓶中，各加入三角瓶中，各加入100ml100ml蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。 交联剂的制备：配制交联剂的制备：配制2%2%浓度的浓度的CaClCaCl2 2，灭菌。，灭

7、菌。 四、实验步骤四、实验步骤11（五）固定化酵母的制备（五）固定化酵母的制备 将酵母湿细胞与将酵母湿细胞与20ml海藻酸钠溶液混合均匀；海藻酸钠溶液混合均匀； 用注射器（不用针头）将海藻酸钠用注射器（不用针头）将海藻酸钠酵母菌混酵母菌混 合液点滴滴入合液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒；溶液中，形成球状颗粒； 常温下静置常温下静置2h，使其充分固化；，使其充分固化； 滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤23遍，即得固定遍，即得固定化酵母细胞。化酵母细胞。 四、实验步骤四、实验步骤12（六）固定化酵母的增殖（六）固定化酵母的增殖 将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖，将固

8、定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖， 2525、200r/min200r/min下增殖下增殖48h48h，观察固定化细胞的大小。，观察固定化细胞的大小。 四、实验步骤四、实验步骤13 （1 1）海藻酸钠的浓度对固定化效果的）海藻酸钠的浓度对固定化效果的影响。影响。 （2 2）利用）利用DNSDNS法检测培养液中葡萄糖浓法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。五、实验结果五、实验结果14 1.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的

9、一环，涉及到实验的成败，一定要按照要求进行操作。海藻酸钠的浓到实验的成败，一定要按照要求进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。酵母细胞的数目少，影响实验效果。六、注意事项六、注意事项15 2.2.刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一段时间，以溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。六、注意事项六、注意事项16七