具杀虫活性雷公藤内生菌F4

1、具杀虫活性雷公藤内生菌 F4-20 发酵条件优化研究雷公藤 (Ttipterygium wilfordii Hook.f.) 为木质藤本植物 , 系卫矛科雷公 藤属, 具有良好的农用活性和医药价值。由于雷公藤能产生一系列有生物活性的 物质, 包括雷公藤甲素、雷公藤生物碱等 ,近二十年来国内外对雷公藤进行广泛的 研究。在医用资源的竞争和雷公藤植物本身繁殖速度缓慢的两重压力下 , 雷公藤生 物碱杀虫剂的资源问题显得更加突出。雷公藤的需求量越来越大 , 大量的雷公藤 野生资源被破坏 , 寻找到能大量产生雷公藤次生代谢产物的材料就成为了当务之 急。本研究从分离自雷公藤根部的一株内生菌 (F4-20)

2、入手,通过 HPLC、LC-MS/MSE实次级代谢产物中含有雷公藤吉碱,并对内生菌培养发酵条件进行 了优化 , 以期提高其杀虫活性和雷公藤吉碱含量 , 为其工业化发酵生产作准备。 现 将结果总结如下：1.在不同温度、初始pH、碳源、氮源和生长素的条件下，通过 检测菌落生长的情况，对F4-20菌株固体培养条件进行了优化。结果表明,F4-20固体培养的最适温度为20C ;不同碳源培养基中,以葡萄糖 作为碳源时菌落生长最快 , 培养 20 d 后菌落直径为 4.47 cm; 不同氮源培养基中 , 豆粉作为氮源时菌落生长最快 , 培养 20 d 后菌落直径为 5.54cm; 培养基的最佳初 始pH值为

3、8.5,最佳生长素为萘乙酸(NAA)。2.采用高效液相(HPLC与液相色谱- 质谱/质谱联用(LC-MS/MS检测,结果显示,F4-20的次级代谢产物中含有雷公藤 吉碱。采用E培养基(ISP2),F4-20次级代谢产物中，雷公藤吉碱(wilforgine)的含 量可达44.2卩g/g。3.以杀虫活性与菌丝干重为指标，对F4-20菌株发酵培养的 基础培养基进行了筛选。结果表明 , 培养基 H为F4-20菌株的最佳基础培养基,培养7 d后,菌丝干重 达 8.89 mg/mL, 菌丝提取物对 3 龄蚊幼和月季长管蚜的杀虫活性分别为 95.67% 和58.34%;在基础培养基H的基础上,通过单因素试验

4、对发酵培养基的最佳碳源 和氮源进行了筛选。结果表明 , 葡萄糖和蛋白胨为 F4-20 菌株发酵培养的最佳碳 源和氮源;在最佳碳源和氮源筛选的基础上 ,以菌丝干重为指标 ,采用响应面分析 法对 F4-20 菌株的发酵培养基进行了优化 ,结果表明,当葡萄糖为 35.7 g/L 、蛋 白胨26 g/L 、七水合硫酸镁 0.059 g/L 、氯化钠 2.38 g/L 、磷酸二氢钾 1.19 g/L、 碳酸钙2.38 g/L、硫酸铵2.97 g/L时，最有利于F4-20菌株的生长，发酵7d后， 菌丝干重可达 13.05mg/mL。在此基础上 , 以菌丝干重为指标 , 利用响应面分析法对 F4-20 菌株

5、的摇瓶发 酵条件进行了优化。结果表明 ,F4-20 菌株摇瓶发酵的最佳条件为 , 转速 140rmp/min,初始pH 7.5,接种量9.04%,装液量94.2 mL/250mL,在此条件下,培 养7 d 后菌丝干重到最大值 15.93 mg/mL。4.F4-20菌株在ISP2培养基发酵培养的过程中，添加MeJA SA H202 GSH 四种诱导子 , 测定外源诱导子对 F4-20 菌株生长和雷公藤吉碱产生的影响。结果 表明,MeJA H202 SA有不同程度的抑制生长作用，而添加GSH后显著促进生长。添加3 mM的GSH处后，菌丝的鲜重最大(4.72 ± 0.40g),为对照的1.

6、39倍 (3.40 ± 0.07 g)。添加MeJA GSH雷公藤吉碱在F4-20菌丝体含量有所降低，但 加入H202、SA经诱导含量增高。添加100卩的SA后，雷公藤吉碱可达45.91 ± 1.26 g,为对照的1.42倍(32.39 ± 2.61卩g/g)。5.内生菌F4-20在5 L、15 L及70 L发酵罐中进行了发酵培养,结果表明 , 不同的搅拌转速、通气量和发酵罐工称容积对雷公藤内生菌F4-20 的生长代谢有较大影响。在5L发酵罐中,搅拌速度200 rpm/min、通气量2.5 L/min时，有利于F4-20 的生长和代谢 , 在此条件下发酵 10 d

7、, 菌丝干重为 12.94 mg/mL; 菌丝干样浓度为 0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性为 56.61%。在15L发酵罐中,搅拌速度 200 r/min、通气量10 L/min,采用发酵培养基和ISP2培养基发酵培养时,菌丝 干重分别为6.02 mg/mL、2.02 mg/mL;菌丝干样浓度为 0.15 g/mL时，对月季长 管蚜的杀虫活性分别为 47.09%和 52.87%。在70L发酵罐中，搅拌速度150rmp/min、通气量40L/min时，菌丝干重为2.43 mg/mL,菌丝干样浓度为0.15 g/mL时，对月季长管蚜的杀虫活性为 37.57%。6.通 过PCF技术对F4-20菌株16SrDNA全序列进行扩增并测序，将此序列与GenBank 中该类菌部分已知种的16SrDNA序列进行