基因多态性分析

1、精品文档人基因多态性分析一、实验目的1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。二、实验原理基因多态性（ gene polymorphism ）是指在一个生物群体中，同时存在两种及 以 上 的 变异 型或 基因 型 或 等 位 基 因 ， 也 称 为 遗传 多态 性（ genetic polymorphism ）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、 毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义； 与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记， 并为分离

2、克隆致病基因提供依据； 病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。聚 合 酶 链 反 应 - 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (polymerasechainreaction Restriction Fragment Length Polymorphism ，PCR-RFLP)分析是一种常用的 DNA分子标记。原理是通过 PCR扩增获得目的基因。 若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失， 则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性， 再利用琼脂糖凝胶电泳分离， 可呈现出多态性电泳图谱。

3、若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。三、器材与试剂1. 器材离心机。DNA扩增仪。电泳仪。水平电泳槽。紫外检测仪。移液器。2. 试剂。1 欢迎下载DNA样品的浓度与纯度。精品文档口腔拭子 DNA抽提试剂盒。琼脂糖。1×TAE电泳缓冲液： 980ml 蒸馏水中加入 50×TAE母液 20ml。50×TAE母液： Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸 28.55ml ，定容至 500ml。上样缓冲液（ 6&

4、#215;）：30mM EDTA，40%(V/V) 甘油， 0.05%（W/V）二甲苯青FF，0.05%（ W/V）溴酚蓝。10 mg/ml 溴化乙锭（ EB）。DNA Marker。四、实验方法1. 基因组 DNA抽提细胞采集：口腔拭子（消毒后的棉签） 擦拭两侧脸颊各 10 次，采集口腔粘膜脱落细胞，将拭子转置于 2mL离心管中，用剪刀将棉签部分剪下， 加入 DNA抽提试剂盒中的 400L 缓冲液 GA。注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染， 取样前 30 分钟内请勿进食和饮水。DNA提取：参照试剂盒说明书操作。样品保存：DNA产物应保存在 -20 ，以防 DNA降解。下次实验再用。2.

5、DNA浓度及纯度检测可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测琼脂糖凝胶电泳法定性检测DNA参照实验 16 DNA琼脂糖电泳。紫外分光光度法定量检测DNA浓度及纯度参照实验 20 动物肝脏 DNA的提取和检测。测定浓度后，稀释至 0.25ug/uL备用。3. 聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)分析查找基因序列。2 欢迎下载精品文档选择你感兴趣的目的基因， 首先查阅文献， 如果已有报道并提供了该基因在Genbank中的 ID 号，可直接在美国国立生物技术信息中心（NationalCenter forBiotechnology Information）中搜索。登陆 ，先选择核

6、酸数据库，点击下拉框选择 Nucleotide ，再把 Genbank ID 号输入搜索框，点击 Search，如（图 25-1 ）：图 25-1查找目的基因步骤1如果只是知道基因的名字，则搜索框中输入基因名称，点击search 。通常会产生大量的搜索结果，例如搜索人乙醛脱氢酶基因，search 后进入如下界面（图 25-2 ），共有 700 余条结果：图 25-2查找目的基因步骤2真核生物基因通常是断裂基因， 含有大量间隔区， 序列庞大， 若查看全基因序列，可点击 Genomic，如果只想获取转录区，点击 Transcript 查看转录本，点击后进入如下界面（图 25-3 ）：。3 欢迎下载

7、精品文档图 25-3 查找目的基因步骤3一些基因通过转录后加工，通常不止一个转录本，例如此处的ALDH2就有 2个，根据你所查阅的文献和这些序列中的解释综合考虑选择你所需要的序列。点击后进入（图 25-4 ）：图 25-4查找目的基因步骤4此页面中有关于该基因信息的详尽描述，可直接到页面底部查看基因序列（图 25-5 ）。4 欢迎下载精品文档图 25-5查找目的基因步骤5设计引物设计引物的常用软件有Primer Premier 5.0，Oligo 6.22等，以及在线设计程序如及 NCBI上的Primer Blast等。这些软件能根据引物设计基本原则以及你的需求，设计并推荐最优引物。引物设计后

8、交由商业公司合成。配制反应体系在冰浴中，将以下成分依次加入无菌PCR管中10×PCR buffer2.5 LdNTP mix（2mM）2l引物 1（10pmol）1l引物 2（ 10pmol）1lTaq聚合酶 （ 2U/l ）0.2 l。5 欢迎下载精品文档DNA模板（ 0.25ug/ l）2 L加 ddH2O至 25 l ，混匀后稍加离心。 PCR在核酸扩增仪上预设以下程序，放入PCR管，启动反应。预变性： 94，5min变性： 94，30sec退火： X，30sec（退火温度通常比引物Tm低 5）延伸： 72，30sec39 cycle末次循环后延伸： 72， 10min限制性酶切利用软件 Primer Premier 5.0寻找酶切位点，选择相应的限制性核酸内切酶，酶切体系及反应条件参照酶试剂说明书。电泳检测配制 3%琼脂糖凝胶，取扩增产物5 -10 ul，进行电泳，同时加DNA分子量标准（ DNA Marker）作对照，紫外检测仪下观察并拍照，并分析结果。5. 统计与分析根据限制性内切酶位点的有无得到一个1( 位点存在 ) 、0( 位点不存在 ) 数据矩阵，统计所有样品的基因型，根据你的需要可用于遗传进化、疾病相关性、群体遗传学等多方面