基因工程原理与技术思考题

1、Chapter IIntroduction1) 什么是基因？基因有哪些主要特点？基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。不同基因具有相同的物质基础.基因是可以切割的。基因是可以转移的。多肽与基因之间存在对应关系。遗传密码是通用的。基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。2) 翻译并解释下列名词genetic engineering 遗传工程gene engineering基因工程： 通过基因操作， 将目的基因或 DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。gene manipulation 基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总

2、称。recombinant DNA technique 重组 DNA 技术gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝， 在技术上主要包括载体构建、 大肠杆菌遗传转化、 重组子筛选和扩大繁殖等环节。molecular cloning 分子克隆3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p44)简述基因工程研究的主要内容？p55) 简述基因工程诞生理论基础 p2和技术准备有哪些 p3？6) 基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？否，密码子简并性7) 举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。医

3、学 :人胰岛素和疫苗农业 :抗虫 BT 农药工业 :工程酿酒酵母Chapter The tools of trade1) 什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p112) II 型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14 ？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些精选文库p14？3) 解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？4) 什么是 DNA 连接酶 p15？有哪几类 p16？有何不同 p16？5) 什么叫同尾酶、同裂酶 p12？在基因工程中有何应用价值？同裂酶：识别位点、 切割位点均相同，来源不同。 在载体构建方面往往可以取得巧妙的应

4、用。应用较多的同裂酶比如 Sma1 和 Xma1 ，它们均识别 CCCGGG ，但前者切后产生钝末端，后者切后产生 粘性末端同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由 同尾酶(isocaudomer)产生的 DNA 片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。6) 什么是 DNA 聚合酶？根据 DNA 聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活性？ p17-18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA 分子引物链的3 -OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。依赖于 DNA 的DNA 聚合酶依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶7)Taq

5、 DNA 聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有 5-3聚合酶活性和 3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。逆转录酶： RNA 指导的 DNA 聚合酶，8)Klenow 片段的特性和用途有哪些？举例说明。p179) 名词解释： S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶 : 甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA 不被相应的限制酶 所切割。10) 什么是末端脱氧核苷酸转移酶？举例说明其应用之一。P19加 p11) 什么是碱性磷酸酶？其在基因工程领域中有哪些用途？p19减 p12) 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效

6、率？目的基因片段与载体由相同的单一限制性核酸内切酶消化酶切后，两者的两端均具有相同的黏性末端，成为单酶切位点的黏性末端。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体的粘性末端的5 p以抑制DNA 的自我环化。-2精选文库若构建表达载体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆。13) gap缺口和 nick 裂口的区别？14) 用寡核苷酸和衔接物 DNA 的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？15) 哪些酶可用于 DNA 片段的末端标记？KlenowDNA聚合酶和 T4 或 T7DNA聚合酶在对 DNA 片段进行末端补平反应或末端

7、的置换反应时可 引入标记的核苷酸。Chapter Host and vectors1) 根据来源和性质不同，可将基因工程载体分为哪些种类？质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体2) 什么是克隆质粒载体？什么是表达质粒载体？什么是穿梭质粒载体？克隆载体是指专用于基因或 DNA 片段无性繁殖的质粒载体。表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。3)基因工程中对载体的基本要求?具有复制子，能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。具有合适

8、的限制性内切酶位点。具有合适的选择标基因。具有较多的拷贝数，易于宿主细胞的染色体 DNA分开，便于分离提纯。具有较小的相对分子质量，易于操作。4) 什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？质粒是染色体外能自我复制的小型DNA 分子。严紧型和松弛型。不亲和性转移性5) 质粒存在的三种形式是什么？ 共价闭合环状 DNA开环 DNA线性 DNA6) 解释质粒的不亲和性和转移性？不亲和性：两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存。转移性：质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。接合型质粒和非接合型质粒。7) 接合性质粒和非接合性质粒有何区别？接合型质粒： 相对分子量

9、大， 除了携带自我复制遗传信息外， 还带有一套控制细菌和质粒接合转移的基因，严紧型质粒。-3精选文库非接合型质粒：相对分子量小，不能携带接合转移基因。8) 理想的质粒载体应具备哪些条件？ 具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。具有多个单一限制性内切酶酶切位点。具有两种以上标记基因。具有安全性。9) 简述 pBR322 质粒载体的主要特征？ P2510)构建噬菌体载体的主要内容有哪些？为什么野生型的噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体 ?该如何改造？ p28插入型和取代型基因组大而复杂11) 何为 -互补，在载体构建中有何作用？ -互补：指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区 段的突变体与带有完整

10、的近操纵基因区段的 -半 乳糖苷酶 （ -galactosidase，由 1024个氨基酸 组成）阴性的突变体之间实现互补。 -互补是基于 在两个不同的缺陷 -半乳糖苷酶阴性的突变体之 间可实现的功能互补而建立的。 将缺失编码第 11-41 位氨基酸的 -半乳糖苷酶基 因称为 lacZ M15 基因而将半乳糖苷酶基因 (lacZ) 的调控序列和编码 -半乳糖苷酶 N 端140个氨基酸 的序列称为 lacZ .这两个基因的产物单独存在时都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以 在载体上加 lacZ /(MSC), 并在受体菌中引入lacZ M15 即可实现 -互补 .IPTG 是lac操纵

11、子的诱导物 ,底物 X-gal 被 -半乳糖苷酶分解后可以产生蓝色.如果质粒载体中插入了外源 DNA, lacZ 的产 物则不能与 lacZ M15 基因的产物实现-互补，在IPTG诱导下不能产生有活性的-半乳糖苷酶，菌落便不可能呈现蓝色。白色菌落便是含有插入了外 源 DNA 的重组质粒。 因此可利用菌落颜色变化来筛选插入外源 DNA 的重组质粒。这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主 要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌-半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后，在含有5-溴 -4-氯 -3-吲哚 - -D- 半乳糖苷（ X-gal ）平板上形成白色的噬

12、菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。12)将外源性 DNA 克隆到-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？13) 简述单链 DNA 噬菌体 M13 在基因工程中的主要用途？14) 什么是 Cos质粒？简述其基本特点。15) 什么是酵母人工染色体、细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体？从哺乳动物中分离出复制起始区、端粒及着丝粒构建载体可以克隆大于1000Kb 的 DNA16) 什么叫插入失活，举例说明之。-4精选文库名称来源特点用途M13 噬菌体载体M13mp1 是构建的第可用来克隆具有不1.可以制备单链一个 M13 噬菌体载同限制末端的外源DNA 进行 DNA 序列体，随后构建

13、的一系列DNA 片段，而且克隆分析。2.可以制备只M13 载体都是在此基片段插入方向是固与外源 DNA 的任意础上经改建派生出来定的。一条链互补的DNA的。探针。3.可以在寡核苷酸介导的基因定点突变来制备含有目的基因的单链DNA 模板。黏 粒 载 体 （ cosmid先用特定的限制性核1.具有噬菌体的体可以克隆外源DNAvector ）酸内切酶局部消化真外包装、高效感染特分子比较大的。核生物的 DNA，产生性。 2.具有质粒载体出高相对分子质量的的易于克隆操作。3.外源 DNA 片段，与经具有高容量的克隆同样的限制性核酸内能力。 4.具有与同源切酶切割过的黏粒载序列的智力进行重体线性 DNA

14、分子惊醒组的能力。体外连接反应。酵母人工染色体由酵母的自主复制序目前克隆最大DNA目前克隆最大DNA列、着丝粒、 四膜虫的片段的载体。片段的载体。端粒、以及酵母的选择性标记组成的能自我复制的酵母线性克隆载体。细菌人工染色体以细菌 F 因子为基础除去了 F 因子的转移可用于真核生物重构建的细菌克隆载体。去及整合区等非复要基因及全基因组制必须片段，并引入物理作图、重要性了多克隆位点及选状基因的图位克择标记 BAC克隆容量隆、基因结构及功可以达到 300kb.能分析。Chapter The technical principle of genetic manipulation1) 简述提取基因组 D

15、NA 的主要步骤和原理？2) 分离纯化质粒的方法有哪几种？简述 CsCl密度梯度分离法、 碱变性法的原理， 如何选择合适的分离方法？3) 简述提取 RNA 常用的两种方法和相关原理？4) 列举三种常用的核酸检测方法和基本原理？5) 简述琼脂糖 -EB 电泳法分离纯化 DNA 的基本原理？-5精选文库6) 名词解释：分子杂交、核酸杂交探针7) 切口平移标记探针的主要步骤有哪些？8) 简述 Southern印迹杂交的基本原理及其主要步骤？9) 简述 Northern 印迹杂交的基本原理及其应用？10) 简述 Western印迹的基本原理及其主要步骤？11) 简述 Sanger碱基顺序分析法的基本原

16、理？12) 简述酵母双杂交技术的基本原理和在基因工程中的应用？13) 简述酵母单杂交技术的基本原理和操作过程？14) 什么是噬菌体展示技术？简述其基本操作过程？15) 什么是 DNA 迁移率变动试验？简述其基本原理？16) 什么是 DNase I 足迹实验？简述其基本原理？Chapter Polymerase Chain Reaction Technology and Application1) 什么是 PCR技术？简述其基本原理？2) 简述 PCR 反应体系的主要成分与反应流程？3) 简述 PCR引物设计的目的和一般原则？4) 简述提高 PCR反应特异性的因素和措施？5) 什么是巢式 PCR

17、、降落 PCR、反转录 PCR？它们分别有哪些应用？6) 简述荧光定量 PCR的基本原理？为什么在定量 PCR中要引入 Ct值的概念？Chapter RNAi and miRNA regulation1) 什么是 RNA干扰技术？2) 简述利用 RNA干扰技术沉默基因的基本原理和一般操作流程？3) 什么是 siRNA？如何选择 siRNA靶位点？4) 简述获得 siRNA的途径有哪些？Chapter Obtaining of target gene1) 目的基因克隆时常用哪些方法分离和获得基因？2) 什么是基因文库？简述构建基因文库常用的载体有哪些？3) 什么是基因组文库？ 简述构建基因组文库

18、的一般步骤？-6精选文库4) 什么是 cDNA 文库？简述构建 cDNA 文库的主要步骤？5) 目的基因与载体的连接方法有哪些？各有哪些优点？基因重组时在两个酶切位点中其中有一个不相匹配时，你如何解决连接问题？6) 如果目的基因的基因结构中有内含子存在， 而且要采用原核表达系统， 你应如何分离克隆基因？Chapter Recombination and gene transfer1)cDNA 克隆较之基因组克隆的优越性体现在哪里?2) 试述 T-A 克隆法的原理和用途？3) 基因工程宿主菌必需具备哪些特性？4) 名词解释：受体细胞、感受态细胞、转化、转染、转导5) 简述将重组 DNA 导入原核

19、细胞的方法有哪些？6) 简述将重组 DNA 导入真核细胞导的方法有哪些？7) 外源基因导入植物的方法？8) Ti 质粒的结构特点？ Ti 质粒介导植物基因转移的过程？Chapter Screening and identification of recombinant clones1) 如何从所克隆到的基因重组载体中鉴定目的基因的存在和正确性2) 重组子的筛选与鉴定主要有哪些方法？3) 重组子的遗传学检测法主要包括哪两类？4) 简述根据载体表型特征进行重组子筛选的常用方法及其基本原理？5) 如何利用抗性标记基因筛选阳性克隆？6) 名词解释：插入失活效应7)LacZ 基因通常用于构建质粒载体的目的和原理？如何利用LacZ 标记基因筛选阳性克隆？8)报告基因检测法筛选重组子对报告基因有哪些基本要求?举例说明重用的报告基因有哪几种？Chapter Expression of cloning gene1) 大肠杆菌作为基因工程受体菌有哪些优缺点？-7精选文库2) 实现真核基因在大肠杆菌表达系统的正确表达需要哪些基本条件？3) 名词解释：启动子、终止子、 SD序列、包涵体4) 蛋白质包含体复性的方法有哪些？5) 可使外源基因在大肠杆菌中高