生物化学教研室

1、生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷实验二实验二 改良的微量凯氏定改良的微量凯氏定氮法测定血清蛋白质含量氮法测定血清蛋白质含量生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷前前 言言 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（缩尿法（BiuretBiuret法）、法）、FolinFolin酚酚试剂试剂法法（LowryLowry法）和紫外吸收法。还有二种近十法）和紫外吸收法。还有二种近十年才普遍使用起来的新的测定法

2、，即考马年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（斯亮蓝法（BradfordBradford法）和法）和BCA法。法。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷由实验题目引发的思考由实验题目引发的思考？实验实验思路思路蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的测定方法有哪些？蛋白质的测定方法有哪些？本次实验利用了哪个性质？本次实验利用了哪个性质？生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.学习微量凯氏定氮法的原理。学习微量凯氏定氮法的原理。 2.2.掌握掌握721721型分光光度计的使用。型分光光度计的使用。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 蛋白质是机体内主要

3、的含氮化合物，血清中含蛋白质是机体内主要的含氮化合物，血清中含有蛋白质，也含有少量的非蛋白质含氮化合物。有蛋白质，也含有少量的非蛋白质含氮化合物。 根据蛋白质中氮元素含量相当恒定（一般平均根据蛋白质中氮元素含量相当恒定（一般平均为为16）这一特点即可得到血清蛋白质含量。）这一特点即可得到血清蛋白质含量。血清总含氮量非蛋白含氮量血清中蛋白质含氮量血清总含氮量非蛋白含氮量血清中蛋白质含氮量 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 血清总含氮量血清总含氮量? ?非蛋白含氮量非蛋白含氮量? ?生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷血清血清总含总含氮量氮量1.氧化并固定有机氮质（消化）氧化并固定

4、有机氮质（消化）硫酸亚硒酸硫酸亚硒酸加热加热含氮有机含氮有机化合物化合物NH3NH3 CO2 SO2 H202.显色显色,比色比色:（NH4）2SO4与碱性钠氏试剂作用与碱性钠氏试剂作用（NH4）2SO42NaOHNa2SO4 2NH4OH 2NH4OH (KI2) HgI2 NH2Hg2I3 4KI NH4I 2 H20生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷血清中血清中非蛋白氮非蛋白氮NaNa2 2WOWO4 4 H2 2SOSO4 4 H2 2WOWO4 4 NaNa2 2SOSO4 4 1.制备无蛋白血滤液（钨酸法）制备无蛋白血滤液（钨酸法） 2.消化后，经显色比色获得实验数据消化后

5、，经显色比色获得实验数据 H2 2WOWO4 4使蛋白质变性获得沉淀，过滤后得使蛋白质变性获得沉淀，过滤后得无蛋白血滤液无蛋白血滤液 血清中含有非蛋白质的含氮化血清中含有非蛋白质的含氮化合物（如尿素、尿酸、肌酐、肌酸、合物（如尿素、尿酸、肌酐、肌酸、氮、氨基酸等），其中氮、氨基酸等），其中所含的氮称所含的氮称为非蛋白氮为非蛋白氮（Non protein nitrogen）通常简写为）通常简写为NPN .生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1 1、无蛋白滤液的制备、无蛋白滤液的制备取血清取血清0.25ml0.25ml置于中置于中试管中试管中加蒸馏水加蒸馏水4.00ml4.00ml混匀混匀加

6、加1010钨酸钨酸钠钠0.25ml0.25ml混匀混匀加加1/3mol1/3molL L-1-1硫酸硫酸0.25ml0.25ml混匀后静置混匀后静置5 5分钟分钟过滤制备无过滤制备无蛋白血液蛋白血液生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷2 2、稀释血清的制备、稀释血清的制备( (由教师准备，学生无需操作由教师准备，学生无需操作) )取血清取血清0.25ml0.25ml100ml100ml容容量瓶中量瓶中加蒸馏水加蒸馏水至刻度至刻度生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷3 3、消化、消化稀释血清稀释血清 1.00ml 1.00ml 无蛋白滤液无蛋白滤液 1.00ml1.00ml置于硬质管

7、中置于硬质管中加消化液加消化液0.20ml0.20ml冷却后冷却后显色显色木夹夹住，距管口木夹夹住，距管口1/31/32/32/3交界处交界处于外焰均热后于外焰均热后加热加热5 58 8分钟分钟无无黑黑 白烟白烟棕色棕色无色无色各加一粒各加一粒玻璃珠玻璃珠生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷4 4、显色、显色测定测定NPN标准标准空白空白硫酸铵标准液硫酸铵标准液（0.04mgN/ml）1.00消化液消化液ml0.200.20蒸馏水蒸馏水ml6.906.905.806.80纳氏试剂纳氏试剂ml3.003.003.003.005 5、比色（、比色（440nm440nm），记录数据。），记录数

8、据。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷计算公式：计算公式：(1)每每100ml血清总含氮量血清总含氮量:（单位：（单位：g N/100ml） C测测=A测测/A标标C标标稀释倍数稀释倍数(2)每每100ml血清非蛋白含氮量：血清非蛋白含氮量：（单位：（单位：g N/100ml） CNPN=ANPN/A标标C标标稀释倍数稀释倍数(3)每每100ml血清蛋白含氮量：血清蛋白含氮量：（单位：（单位：g N/100ml） Cpro= C测测 CNPN(4) 血清蛋白质含量：血清蛋白质含量： （单位：（单位：g/100ml） Cpro6.25生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1 1、各样

9、品管加液顺序为：横向依次加入，每加、各样品管加液顺序为：横向依次加入，每加 一种试剂均需要充分混匀；一种试剂均需要充分混匀；2 2、避免试剂交叉污染；、避免试剂交叉污染；3 3、加热消化时试管管口不能对着自己或他人；、加热消化时试管管口不能对着自己或他人；4 4、回收玻璃珠；、回收玻璃珠；生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 1 1、过滤无蛋白滤液前，滤纸是否可以预先湿润？、过滤无蛋白滤液前，滤纸是否可以预先湿润？为什么要制备无蛋白滤液？为什么要制备无蛋白滤液？ 2 2、无蛋白滤液如果不是无色透明，说明可能存在、无蛋白滤液如果不是无色透明，说明可能存在什么问题？什么问题？ 3 3、稀释血

10、清及无蛋白滤液消化显色后所测的含氮、稀释血清及无蛋白滤液消化显色后所测的含氮量有何区别？量有何区别？ 4 4、除采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量以外？、除采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量以外？还可以利用哪些方法测定其含量，分别利用了蛋还可以利用哪些方法测定其含量，分别利用了蛋白质的什么性质。能否举出一、两种方法？白质的什么性质。能否举出一、两种方法？思思 考考生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷实验三实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳电泳法的原理电泳法的原理 P P26-3326-33实验三的原理与操作步骤实验三的原理与操作步骤生物化学教研室生物化学教研室 朱欣

11、婷朱欣婷补补 充充 内内 容容生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷一、微量凯氏定氮法测定蛋白质一、微量凯氏定氮法测定蛋白质（1）消化：）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为氧化为CO2和和H2O蒸蒸汽逸出，而汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。酸性溶液中。（2）显色、比色：硫酸氨与碱性的纳氏试剂作用生成棕色）显色、比色：硫酸氨与碱性的纳氏试剂作用生成棕色胶体溶液。同样处理标准硫酸氨溶液比色。胶体溶液。同样处理

12、标准硫酸氨溶液比色。（3）除去）除去NPN的影响。的影响。（4）利用钨酸使蛋白质变性的原理制备无蛋白质滤液。）利用钨酸使蛋白质变性的原理制备无蛋白质滤液。（5）血清总氮量）血清总氮量NPN，根据，根据蛋白质含氮量通常在蛋白质含氮量通常在16 %左左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得，便得到该样品的蛋白质含量。到该样品的蛋白质含量。 灵敏度低，灵敏度低，适用于适用于0.21.0mg氮，氮，误差为误差为2费时。费时。 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷二、双缩脲法（二、双缩脲法（ Biuret法）法）H2N-CO-NH2 + NH

13、2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。白质浓度成正比。 本法本法测定蛋白质范围测定蛋白质范围1-20mg1-20mg生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷三、三、Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成形成络合物。络

14、合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进引进Folin试剂试剂(磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂)，蛋白质，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。正比例。 优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏敏1020倍，较双缩脲法灵敏倍，较双缩脲法灵敏100倍。倍。 缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷

15、朱欣婷四、紫外分光光度法测定蛋白质浓度四、紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，与其含量呈正比关系，可用作定量测定。可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。简便、不消耗样品，低浓度

16、盐类不干扰测定。 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷五、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度五、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料，因此可以通过测定染料在在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比（比Lowry法灵敏法灵敏4倍）。倍）。 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷六、六、 BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）二辛可宁酸、二羧基二喹啉） 原理：原理：碱性条件下，蛋白将碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为还原为Cu+， Cu+与与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定试剂形成紫颜色的络合物，测定其在其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。比，即可计算待测蛋白的浓度。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷BCA的优点的优点 准确灵敏：准确灵敏：BCABCA试剂的蛋白质测定范围是试剂的蛋白质测定范围是20202000g/ml2000g/