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文档简介

1、DNA聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增一步法一步法ComponentsVolume(l)RNA8(1g)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/l)0.4AMV-RT(10U/l)1.0DEPC-H2O3.6Total20两步法两步法ComponentsVolume(lR.T.Product5.010 xPCR buffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21Taq DNA polymerase1ddH2O12Total25cDNA PCR扩增扩增 cDNA第一链合成反应第一链合成

2、反应 过程中过程中cDNA第一第一链合成反应所用的枪头、链合成反应所用的枪头、枪头盒、枪头盒、PCR管等塑料制管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制高压灭菌后使用。玻璃制品在品在180干烤干烤6-8小时。小时。加样过程在超净台内进行，加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。需戴手套与口罩。 cDNA PCR扩增的准备工作同普扩增的准备工作同普通通PCR反应。反应。 cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、第一链合成反应所用枪头、枪头盒、PCR管管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在使用。玻

3、璃制品在180干烤干烤6-8小时。在超净小时。在超净台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手套与口罩。套与口罩。 cDNA PCR扩增的准备工作同普通扩增的准备工作同普通PCR反应。反应。在在PCR仪上设定程序进行反应。仪上设定程序进行反应。6X载载1g 琼脂糖加入琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到溶解。（冷却到60，加入，加入5l的的，并摇匀。）并摇匀。）装好制胶板，装好制胶板，插入适当梳子插入适当梳子，将溶解的琼，将溶解的琼脂糖（约脂糖（约50）

4、倒入，室温冷却凝固。）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液至液面覆盖凝胶至液面覆盖凝胶1-2mm。用移液器吸取用移液器吸取PCR产物产物10l于封口膜上，再于封口膜上，再加入加入2l 的的6X载样缓冲液，混匀后，载样缓冲液，混匀后，小心小心加入点样孔加入点样孔。打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至50-100V，可，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约约30min-60min。将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯，将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯，可见到发出荧光的可见到发出荧光的DNA条带。条带。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的配制

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