高效液相色谱仪操作步骤

1、高效液相色谱仪操作步骤1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3. 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4. 进入HPLC控制界面主菜单，点击 manual ,进入手动菜单。5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge ,再点击start,冲洗时速度不要超过10ml/min 。6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选

2、用合适的流速，点击on,走基线，观察基线的情况。7. 设计走样方法。点击 file，选取select users and methods ,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同 的样品而不同。8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun ,可记录数据和做标记等。

3、全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线， 洗掉剩余物。9. 关机时，先关计算机，再关液相色谱。10. 登记。问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决？答:关于漂移问题：1 .温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2. 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3. 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1 .流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2. 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3. 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合二、 问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双

4、峰的原因是什么？</B>答:1 .筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2. 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子三、 问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法</B>答:1 .样品量不足，解决办法为增加样品量2. 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3. 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器4. 检测器衰减太多。调整衰减即可。5. 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数6. 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。7. 检测池中有气泡。解决办法为排气。8. 记录仪测压范围

5、不当。调整电压范围即可。9. 流动相流量不合适。调整流速即可。10 .检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。四、问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？ </B> 答：原因可能有：1 .泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；2. 比例阀失效，更换比例阀即可；3. 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；4. 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；5. 系统检漏，找出漏点，密封即可；6. 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。五、问：我购买的 HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？</B>答：柱压

6、过高是 HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱 子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。1 .拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2. 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下 降，再检查；3. 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4. 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一

7、个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。Agilent1100液相基本操作步骤（一）、开机：1、打开计算机，进入 Windows NT （或 Windows 2000）画面，并运行Bootp Server 程序。2 、打开1100 LC各模块电源。3 、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面如下所示。4、从 “View”菜单中选择 “Method and Runcontrol ”画面，单击” View” 菜单中的 “Show Top Toolbar

8、”，“Show status toolbar , “Systemdiagram , ” Sampling diagram ,使其命令前有“V 标志，来调用所需的界 面。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开Purge阀。7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump选项，进入泵编辑 画面。8 、设 Flow: 5ml/min，单击 OK9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击 Pumpcontrol选项，选中On, 单击OK则系统开始Purge,直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止 ，切 换通道继续Purge,直到所有要用通道无气泡为止。10、单击Pumpffl标，出现

9、参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off, 单击Ok关泵，关闭Purge valve 。11、 单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump选项，进入Pump 编辑画面，设 Flow: 1.0ml/min。12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体 积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击 Ok。（二）数据采集方法编辑：1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“ Edit entire method ” 项，如上图所示选中除“Data analysis”外的三项，单击Ok,进入下一画面。2 、方法信息：在“Method Com

10、ments中加入方法的信息（如：方法的用途等）。单击Ok进入下一画面。3、泵参数设定：(以二元泵为例) 在“Flow”处输入流量，如1ml/min，在“Solvent B ”处输入 70.0,(A=100-B), 也可 Insert 一行” Timetable ” ,编辑梯度。在 “ Pressure Limits Max ”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 单击Ok进入下一画面。4、白动进样器参数设定：选择合适的进样方式，如图所示，进样体积1.0ul ,洗瓶位谿为6号。“Standard Injection -只能输入进样体 积，此方式无洗针功能。“ Injection with Nee

11、dle Wash' - 可以输入进样体积和洗瓶位谿，此方式针从样品瓶抽完样品后， 会在洗瓶中洗针。“ Use injectorprogram” -可以点击Edit键进行进样程序编辑。点击Ok进入下一画面。5、柱温箱参数设定： 在” Temperature ”下面的方框内输入所需温度，并选中它，点击” more>>'键，如图所示，选中” Same as left -使柱温箱的温度左右一 致。 点击ok进入下一画面。6、VW睑测器参数设定： 在” Wavelength ”下方的空白处输入所需的检测波长，如254nm,在” Peak width (Response tim

12、e) ”下方点击下拉式三角框，选择合适的响应时 间,如>0.1min (2s) 。 在 Timetable 中可以 “ Insert ” 一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm点击ok进入下一画面。7、DAD佥测器参数设定： 检测波长：254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm; 检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW 一股选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸 收区域。参比带宽BW至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作 为缺省值。Peak width (Response tim

13、e ):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。 Slit 狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步 长，范围，阈值。选中所用的灯。 点击Ok进入下一画面。8、RID检测器参数设定： 色谱条件：进样体积:20ul 。光学单元温度：Off 。极性：正。峰宽(响应时间):4s 。 如图所示："Optical Unit Temperature -若环境温度控制在土 2C，设定为Off,若环境温度不稳定，则设定光学单元温度为高于环境温度5度，以防样品在池中沉淀。“ Peak width” -大多数分析设为4S,只有在高速分析下设 为更短。"Automatic recy

14、cling after analysis ” -在不进行分析时可以让 流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。 * 点击RID图标，选择 RID Control : Heater设为On,若要循环 流动相，必须将“ Recycling Valve ”设为ON手动purge参比池，将其设为 On,并输入Purge时间。9、FLD检测器参数设定：色谱条件： 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为1：10。 进样体积：5ul o 柱温箱：30 C。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=1Q 响应时间=4s. 停止时间： 出峰完毕。 Excitation A：

15、激发波长：200-700nm,步长为 1nm,或 Zero Order 。Emission :发射波长:280-900nm, 步长为 1nm,或 Zero Order。 PMT大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头，则减少PMT值。 “Peak width:大多数应用设为4s,只有快速分析采用小的设定值。 Multi Ex :多波长及光谱（激发）。 Multi Em :多波长及光谱（发射）。 同时可以输入范围Range步长step、采集光谱。10、在“ Run time checklist ”中选中 “ Data acquisition ” ,单击Ok11、单击 “Method”

16、 菜单，选中 “ Save method as”，输入一方法名，如“test ”，单击。虻12、从菜单“View” 中选中” Online signal ，选中 Windows1,然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中，点击 Ok.（如同时检测二个信号，则重复12,选中Windows 2）。13、从 “Run control ”菜单中选择 “ Sample info ” 选项，如上图所示，输入操作者名称，在“ Data file”中选择“ Manual”或“Prefix ”。区别：Manual-每次做样之前必须给出新名字，否则仪器会将上次的数据覆盖掉。Prefix 在Prefi

17、x 框中输入前缀，在Counter框中输入计数器的起始位，仪器会白动命名，如vwd0001,vwd0002,。14、从 Instrument 菜单选择 System on。15、 等仪器Ready,基线平稳，从Method菜单中选择“Runmethod”， 进样。(DAD, VW匝谱图如下所示：)(三) 、数据分析方法编辑:1、从“View”菜单中，单击" Data analysis ”进入数据分 析画面。2、从“File ”菜单选择“ Load signal ”，选中您的数据文 件名，如下图所示。单击O43、做谱图优化，从“Graphics ”菜单中选择“Signal option

18、s ” 选项，。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间， 单击ok,或选择” Use Ranges”调整。反复进行，直到 图的比例合适为止。4、积分：(1) 、从"Integration ”中选择 “Auto integrate ”，如积分结果不理想，再从菜单中选择 Integration Events”选项，选择合适的 Slope sensitivity ,Peak width , Area reject , Height reject 。(2) 、从"Integration ”菜单中选择Integrate ”选项，则数据被积分。(3) 、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。(4) 、单击左边 W 图标，将积分参数存入方法。5、打印报告：(1)、从“Report ”菜单中选择“ Specify report ”选项，进入如上画面。、单击&quo