黄酮化合物芦丁的提取分离和鉴定

1、河南理工大学天然产物的分离与纯化实验专业班级学 号姓 名准备教师斯琴格日乐指导教师斯琴格日乐时 间 201 0- 2011年 第 2 学期目录讲义内容：实验一小篥碱的提取、精制、鉴定及含H测定-4学时实验二 黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定-4 学时实验三阿魏酸的提取、分离和鉴定 4 学时报告内容：预习报告实验报告12实验二黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定一、目的要求1、通过芦丁的提取与精制掌握超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握高效液相法分析黄酮类化合物二、重点难点3、芦丁的提取方法：超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。4、掌握 HPLCa三、学时 4学时四、实验原理高效液相色谱

2、法(HPL。是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法的基础上发展起来的新型分离方 法。高效液相色谱法中反相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色，它是基于溶质在极性流动相和非极性 固定相表面之间的疏水效应建立的一种色谱模式。应用反相HPLC分析黄酮类化合物，一般优先选甲醇 -水体系为流动相。为了提高分离度，常常需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解 离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相HPLC中需加入酸如乙酸调节PH,抑制解离，克服拖尾现象。本研究以芦丁为对照品，通过高效液相来测定怀菊花的黄酮含量。五、仪器与试剂怀菊花，HPLC超声提取器，

3、医用离心机，真空泵，芦丁标准品，甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯等。.六、方法色谱柱：Ci8柱(4.6mmX50mm,5gm,);流动相：甲醇-0.2%冰乙酸(25:75);流速:0.50mL min-1;检测波长：260nm柱温：25°C;进样量为们上；在此条件下测得黄酮含量的色谱图。七、实验内容1. 对照品溶液的配制分别精密称取芦丁对照品 10mg用30/醇溶解，置100ml棕色容量瓶里，加30%L醇配制成浓度为0.1mgmL1的对照品溶液；然后从 0.1mgmL1的对照品溶液分别取 2mL 4mL 6mL 8mL 10mL置50mL棕 色容量瓶中，加 30%醇配制成 4ug mL1,

4、 8ug mL1, 12ugmL1, 16ug mL1 , 20ug mL1的标准溶液，备用。2. 样品溶液的制备原料的预处理：选取市售怀菊花若干，洗净，晾干，之后放入电热鼓风干燥箱60 C的条件下烘干，烘干之后，然后用搅碎机搅成粉末，研磨，过筛，备用。准确称取怀菊花0.2g，放在具塞锥形瓶中，加4mL浓度为70%勺乙醇，密塞，超声提取 1h,放冷，在 离心机离心30min,将上清液在真空抽滤机下过滤，再用 0.45卬m微孔滤膜滤过，取过滤液，定容至50ml 容量瓶，备用。3. 空白试验取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液各10山依法测定，结果表明，空白样品中有无干扰。4.线性关系的考察以上

5、述4ug mL1 , 8ug mL1 , , 12ugml_1, , 16ug mL , , 20ug mL1，的标准溶液为横坐标(X),以峰面 积为纵坐标(Y)进行线性回归，得方程为 y=33.29x-8.284 , r=0.9993 ,结果表明线性关系良好。浓度ug mL',48121620峰面积119254|386525662广杯麻住用7M於 号:b'KMl 何家 0 9993500岬 400fill300IOC -I/ A -100-I1.1.!.1.10SIfl1S305、精密度试验以上述4ug mL1 , , 8ugmL1 , , 12ugmC, , 16ug mL

6、1, , 20ug mL1 ,的标准溶液，按上述色谱条件测 定，每次进样10uL,重复进样6次，结果封面积的 RSDJ、于5%说明精密度良好。6、稳定性试验精密量取供试品溶液 10uL,分别在1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, 10h , 12h, 24h进样，测定峰面积，在 24h内其RSDJ、于5%说明样品的稳定性好。7. 重复性试验取怀菊花样品，精密称取5份，每份0.2g,按上述方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算 芦丁含量平均值，结果表明可以重复试验。8. 加标回收率试验量取已知含量的样品1mL然后加4ug mL1的芦丁标准溶液2mL摇匀，按上述色谱条件进样 10

7、uL,测 定峰面积，计算平均回收率。9. 样品测定取怀菊花0.2g,按2法制备成样品溶液，分别取对照品溶液和样品溶液各 10 M进样,在上述色谱条件下测 定，按外标法计算芦丁的含量。结果见表。测定提取出的样品结果编号峰囱积浓度(ug/mi )尸含量（mg/g）1号195.46.1215.32号202.06.3215.8天然产物的分离与纯化实验预习报告实验项目:黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定一、实验目的：1、通过芦丁的提取与精制掌握超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握高效液相法分析黄酮类化合物二、实验原理：高效液相色谱法（HPL。是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法的基础上发展

8、 起来的新型分离方法。 高效液相色谱法中反相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色，它是基于溶质在极性流动相和非极性固定相表面之间的疏水效应建立的一种色谱模式。应用反相HPL%析黄酮类化合物，一般优先选甲醇-水体系为流动相。为了提高分离度，常常 需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相HPLC中需加入酸如乙酸调节PH抑制解离，克服拖尾现象。本研究以芦丁为对照品，通过高效液相来测定怀菊花的黄 酮含量。三、实验内容及步骤：1. 对照品溶液的配制分别精密称取芦丁对照品10mg,用30%醇溶解，置100ml棕色容量瓶

9、里，加 30%乙醇配制成浓度为 0.1mg mH1的对照品溶液；然后从0.1mg mL1的对照品溶液分别取 2mL 4mL 6mL, 8mL, 10mL置50mL棕色容量瓶中，加 30沼醇配制成 4ug - mL1 , 8ug - mL1 , 12ug - mL1 , 16ug - mL1 , 20ug - mL 的标准溶液，备用。2. 样品溶液的制备原料的预处理：选取市售怀菊花若干，洗净，晾干，之后放入电热鼓风干燥箱60 C的条件下烘干，烘干之后，然后用搅碎机搅成粉末，研磨，过筛，备用。准确称取怀菊花 0.2g ,放在具塞锥形瓶中，加4mL浓度为70%勺乙醇，密塞，超声提 取1h,放冷，在离

10、心机离心 30min,将上清液在真空抽滤机下过滤，再用 0.45m微孔 滤膜滤过，取过滤液，定容至50ml容量瓶，备用。3. 空白试验取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液各 10 1,依法测定。4. 线性关系的考察以上述 4ug - mL1 , 8ug - mL1, , 12ug - mL1 , , 16ug - mL1, , 20ug - mL1,的标准溶 液为横坐标（X）,以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。5. 精密度试验以上述 4ug - mL1 , , 8ug - mL1, , 12ug - mL1 , , 16ug - mL1, , 20ug - mL1 ,的标准 溶液，按上述色

11、谱条件测定，每次进样10uL,重复进样6次。6. 稳定性试验精密量取供试品溶液 10uL,分别在1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h进样， 测定峰面积。7. 重复性试验取怀菊花样品，精密称取5份，每份0.2g,按上述方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量。8. 加标回收率试验量取已知含量的样品 1mL然后加4ug mL1的芦丁标准溶液 2mL摇匀，按上述色谱 条件进样10uL,测定峰面积，计算平均回收率。9. 样品测定取怀菊花0.2g,按2法制备成样品溶液，分别取对照品溶液和样品溶液各10祉进样，在上述色谱条件下测定，按外标法计算芦丁的含量。四、预习中发

12、现的问题及解决方法：1、标准样品放置久了，会变质吗？答：会的，因为芦丁是一种生物活性物质。2、 流动相里为什么要加少量冰乙酸，加到PH值为多少合适？答：为了提高分离度，常常需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部 分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相 HPLC中需加入酸如乙酸调节 PH,抑制解离，克服拖尾现象。五、实验过程原始记录:芦丁标准样品的峰面积浓度ug - mL148121620峰面积119254386525662测定提取出的样品结果编亏峰面积浓度芦J'含量(ug/ml )(mg/g)1号195.46.1215.32号202

13、.06.3215.8指导教师签字：年_月_日天然产物的分离与纯化实验预习报告实验项目：一、实验目的：二、实验原理:三、实验内容及步骤:四、预习中发现的问题及解决方法:五、实验过程原始记录:指导教师签字：年月日专业同组人课程名称:实验项目:、实验目的:如上二、实验原理:如上天然产物的分离与纯化实验实验报告班级姓名学号实验时间年 月 日实验成绩天然产物化学黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定三、实验内容及步骤:如上四，、讨论：超声波提取技术用于类黄酮提取时具有提取时间短，提取率高、低温提取、成本低、 污染少、容易实现产业化等优点。本实验采用芦丁对照品作对照，用甲醇-0.2%乙酸水溶剂系统进行梯度洗脱，使其得到了较好的分离，用高效液相操作简单、快速、分离效果好；同时对照品的图谱