qRT-PCRppt课件

1、1 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 2提纲：提纲：n实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理n实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器介绍3实时荧光定量PCR定义定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。4与普通与普通PCR的区别的区别n普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。n实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。5678n荧光

2、阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 910定量PCR的数学原理1112斜率与扩增效率1314荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan151、SYBR Green 法16SYBR Green 熔解曲线分析17SYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探

3、针n非常灵敏n便宜182、TaqMan探针法19TaqMan作用机理20TaqMan法优缺点21 Real-time PCR 方法应用方法应用22n绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究n相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究23绝对定量与相对定量的定义24绝对定量通过标准品定量n绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物25绝

4、对定量：从荧光到拷贝数26相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量27相对定量：参照因子Calibrator 28相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT

5、 （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值29相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度30 定量PCR的实验要素31样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL32标准品33标准品梯度稀释方法34复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求35平台PCR仪介绍ABI 7500 fast使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Rn= Normalization = Reporter / Referenc36Rotor g