2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案(DOC)

1、8i W4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：1/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC 组签名：日期：审核部门：QC 组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部F 表用于记录修订/变更主要内容及历史。文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00按 GMP（ 2010 年修订版）要求新制定2015.10.228i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效

2、日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：2/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案目 录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7. 验证项目和验证方法7.1 试验菌株7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.4 需氧菌总数检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法7.5 控制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法8. 偏差与漏项控制9. 验证报告会审8佛山市华普

3、生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：3/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照中国药典2015 版四部附录 1105:微生物计数法，以及 1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证 以确认所采用的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲

4、硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法 是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物 质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据 验证结果判断是否符合验证标准。2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用 3 批按 GMF 要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。3. 组织及

5、职责3.1 验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部 QC 组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由 QC 组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负 责人批准报告。3.2 验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，由 QC 组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并 将该次的培训记录归档。3.3 验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。3.4 验证工作小组成员表姓名部门及职务职责黄汉新质量负责人/质量受权人负责验证方案及报告的批准胡建新质量部

6、 QA 组长审核验证方案、审核验证报告并协调工作曾凤敏质量部 QC 组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作刘红华质量部 QC负责验证方案起草、具体实施、报告工作4.验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015 年 12 月至 2016 年 1 月。5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：4/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案5.1.主要检验仪器设备确认表序号仪器设备名称型号编号校准单位校准日期有效期至1电子天平2生化

7、培养箱3生化培养箱4生化培养箱5立式压力蒸汽灭菌锅6生物洁净安全柜检查人/日期：复核人/日期:5.2. 验证所需文件的确认表文件名称文件编码是否有效版本文件保存处人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准是 否质量部人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程是 否质量部取样操作规程是 否质量部微生物限度检查操作规程是 否质量部微生物实验室清洁消毒操作规程是 否质量部培养基的管理制度是 否质量部检定菌的保存、传代、使用、销毁规 程是 否质量部LDZX-30FBS 立式压力压蒸汽灭菌器 操作规程是 否质量部SPX-150B 生化培养箱操作规程是 否质量部BHC-1300IIA/B3 生物洁净安全柜操作规程是 否质量部JJ

8、200 电子天平操作规程是 否质量部检查人/日期：复核人/日期:6.验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1. 试验菌种检查表8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：5/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案骨口. 序号菌种名称代码冻干菌种批号来源1金黄色葡萄球菌CMC（B） 26003中国食品药品检定研究院2铜绿假单胞菌CMC（B） 10104中国食品药品检定研究院3枯草芽抱杆菌CMC（B） 63501中国食品药品检定研究院4白色念珠菌CMC（F） 98001中国食品药品检定研究

9、院5黑曲霉CMC（F） 98003中国食品药品检定研究院6大肠埃希菌CMC（B） 44102中国食品药品检定研究院7乙型副伤寒沙门菌CMC（B） 50094中国食品药品检定研究院检查人/日期：复核人/日期:6.2 试验所需的培养基检查8i W4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：6/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案6.3.检验样品确认表骨口. 序号品名生产厂家批号规格是否按 GMP要求生产1人工牛黄胶囊甲硝唑佛山市华普生药业有限公司甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是否2人工牛黄胶囊甲硝唑佛山市华普生

10、药业有限公司甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是否3人工牛黄胶囊甲硝唑佛山市华普生药业有限公司甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是否检查人/日期：复核人/日期:7.验证项目和验证方法7.1 试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡 萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为 大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5 代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。骨口. 序号名称生产厂家是否通过培养 基适用性试验批号01胰酪大豆胨液体培养基北京三药科技开发公司是 否02

11、胰酪大豆胨琼脂培养基北京三药科技开发公司是 否03沙氏葡萄糖液体培养基北京三药科技开发公司是 否04沙氏葡萄糖琼脂培养基北京三药科技开发公司是 否05麦康凯液体培养基北京三药科技开发公司是 否06麦康凯琼脂培养基北京三药科技开发公司是 否07RV 沙门菌增菌液体培养基北京三药科技开发公司是 否08木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼口匕丄立乂甘 脂培养基北京三药科技开发公司是 否09三糖铁琼脂培养基北京三药科技开发公司是 否检查人/日期:复核人/日期:7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml 胰酪大豆胨液体培养基中

12、，3035C培养 1824 小时，取此培养液 1ml 加 0.9 %无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至10-510-7,制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，2025C培养 23 天，取此 培养液 1ml加 0.9 %无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-510-7，制成 50 100cfu/ml 的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2025C培养 57 天，直到获得丰富的 孢子。力口入 35ml 含有 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液

13、，将抱子洗脱，吸至无菌试 管中，取 1ml 加含有0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液 9ml， 采用 10 倍递增稀释法， 稀释至 10-510-7,制成 50100cfu/m的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在 28C,可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28C,在验证过的贮存期内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。7.3.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品 10g,加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1： 10 的供试液。8华普主爲业佛山市华普

14、生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：7/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案7.3.2.试验组取 1: 10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注 不超过 45C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备2 个平皿。置 3035C培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取 1: 10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉

15、，分别注入平 皿中，立即倾注不超过 45C的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 2025C培养箱中培养 5 天，点计菌落数。7.3.3.供试品对照组取 1 : 10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过 45C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，平行制备 2 个平皿。置 3035C培养箱中培养 5 天，点计菌落数。另取 1 : 10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过45C的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml 混匀，平行制备 2 个平皿。置 2025C培养箱中培养 5 天，点计菌落数。7.3.4.菌液对照组取 0.9%无菌氯化钠溶液 1

16、ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即 倾注不超过 45C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 3035C培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、 黑曲霉），点计菌落数。另取 0.9%无菌氯化钠溶液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注 入平皿中，立即倾注不超过 45C的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制 备 2 个平皿。置 2025C培养箱中培养 5 天，点计菌落数。7.3.5.常规倾注平皿

17、法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在 0 .5 ? 2 范围内。7.3.6.常规倾注平皿法方法验证的结果7.3.6.1.常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数 1:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准

18、生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：8/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 2:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 3：人工牛黄甲硝唑胶囊批

19、号：_ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期:7362 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果8i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：9/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试验次数 1:人工牛黄甲

20、硝唑胶囊批号：_ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _;培养时长：5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_

21、 ;培养温度： _;培养时长：5 天试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期:7.3.7.常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.52 范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌 总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。74 需氧菌总数检查一离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备8

22、华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：10/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案取供试品 10g,加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1： 10 的供试液贮备液。取 1:10 的供试液贮备液 50ml，经 500 转/分钟离心 3 分钟，取上清液得供试液。7.4.2.试验组取供试液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2 次（100ml/次），然后在第

23、3 次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035C倒置培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.3.供试品对照组取供试液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混 合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3 次（100ml/次），平行制备 2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035

24、C倒置培养 5 天，点计菌落数。7.4.4.菌液对照组取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml, 200ml 通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，在余下的 100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备 2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035C倒置培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.5.稀释剂对照组依照 7.2 项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50100cfu/ml，然后

25、以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3 次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035C倒置培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.6.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值 应在0 .5 ? 2 范

26、围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数 1:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_；培养温度： _ ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯早芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天（即试验菌的回收率）0 .5 ? 2 范围内。胞菌、枯早芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：11/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方

27、法验证方案试验菌株菌 种代 数试验组供试品对照组菌液对照组稀释剂对照组 试验组 各菌株回 收率稀释剂对 照组各菌 株回收率12均值112均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 2:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯早芽抱杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：12/20人工牛黄甲哨唑

28、胶囊微生物限度检查方法验证方案试验菌株菌种 代数试验组供试品对照组菌液对照组稀释剂对照组 试验组 各菌株回 收率稀释剂对 照组各菌 株回收率12均 值112均 值12均 值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数 3:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _培养箱 型号_编号_ ;培养温度： _ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单8i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：13/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试验菌株菌

29、种 代数试验组供试品对照组菌液对照组稀释剂对照组 试验组 各菌株回 收率稀释剂对 照组各菌 株回收率12均 值112均 值12均 值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期:7.4.8.离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在组各试验菌株的的回收率也在0.52 范围内，则可确认离心沉淀0.52 范围内，稀释剂对照-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总 数 检 查 。 人 工 牛 黄 甲 硝 唑 胶 囊 照 此 验 证 过 的 供 试 液 制 备 方 法 及 计 数 方 法 进 行 需 氧 菌 总 数

30、计 数 。7.5.控制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法若在 7.3 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法的试验中，证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制 菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。7.5.1 试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选 择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过5 代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.5.2 控制菌检

31、查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、 乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，308i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：14/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案35C培养 1824 小时，取此培养液 1ml 加 0.9 %无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀 释至 10-510-7,制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28C,可在 24 小时内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证

32、。7.5.3 大肠埃希菌检查方法验证7.5.3.1 供试液的制备取供试品 10g，加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1： 10 的供试液贮备液。取 1:10 的供试液贮备液 50ml，经 500 转/分钟离心 4 分钟，取上清液得供试液。7.5.32 试验组取供试液 10ml，加至 100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 2 次（100ml/次），然后在第 3 次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入 7.5.2 项下制备的 50100cfu 的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混

33、匀，3035C培养 1824 小时。取上述增菌培养物 1ml 接种至 100ml 麦康凯液体培养基中，4244C培养 2448 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035C培养 1872 小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。7.5.3.3阳性对照组照 7.5.2 项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50100cfu/ml，然后以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，以

34、 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3 次（100ml/次）。取膜接种至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035C培养 1824 小时。取上述增菌培养物 1ml 接种至 100ml 麦康凯液体培养基中，4244C培养 2448 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035C培养 1872 小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。7.5.3.4阴性对照组取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，取膜接种 至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀， 3035C培养 1824 小时。阴性对照应无

35、菌生长。7.5.3.5 离心沉淀-薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法验证结果8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：15/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试验次数 1 人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_大肠埃希菌对照菌来源 _批号（菌种编号）_过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号型号编号:型号编号温度c温度c温度c培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性 对照

36、组阴性 对照组试验人/日期：复核人/日期:试验次数 2:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：_大肠埃希菌对照菌来源 _批号（菌种编号）_过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号型号编号:型号编号温度c温度c温度c培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性 对照组阴性 对照组试验人/日期:复核人/日期:8佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：16/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试验次

37、数 3:人工牛黄甲硝唑胶囊批号 ：_大肠埃希菌对照菌来源 _批号（菌种编号）_过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号型号编号:型号编号温度c温度c温度c培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性 对照组阴性 对照组试验人/日期：复核人/日期:7.5.3.6 大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌，阴性对照组 无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照 此验证过

38、的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查。7.5.4 沙门菌检查方法验证7.5.4.1 供试液的制备取样品 10g 加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100 ml 制成 1:10 的供试液。取全部供试液经500 转/分钟离心 4 分钟，取全部上清液为供试液。7.5.42 试验组取全部供试液，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 2 次（100ml/次）。然后在第 3 次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入 7.5.2 项下制备的 50100cfu 的乙型副伤寒沙门菌，过滤。取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混

39、匀，3035C培养 1824 小时。取上述增菌培养物 0.1ml 接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基，3035C培养 1824 小时。取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035C培养 1848 小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或 半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高8i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：17/20人工牛黄甲哨唑胶囊

40、微生物限度检查方法验证方案层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824 小时。7.543 阳性对照组照 7.5.2 项下菌液制备方法，以 0.9%无菌氯化钠为稀释液，将乙型副伤寒沙门菌液稀释至含菌 50100cfu/ml，然后以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次（100ml/次）。取膜接种至 200ml 胰酪大 豆胨液体培养基中，混匀，3035C培养 1824 小时。取上述增菌培养物 0.1ml 接种

41、至 10mlRV 沙门增菌液体培养基，3035C培养 1824 小时。取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035C培养 1848 小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或 半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高 层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824 小时。7.5.4.4阴性对照组取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml，全量通过薄膜（孔径 0.45 卩 m 混合纤维素膜）后，取膜接种 至 200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀， 3035C培养 1824 小时。阴性对照应无菌生长。7.5.4.5 离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果8华普主葯业i W 4佛山市华普生药业 有限公司文件类型：技术标准生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00页数：18/20人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试