当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV304细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响

1、当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响【摘要】 目的 探讨当归红芪合剂超滤膜提取物对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响。方法 以体外培养的ECV-304细胞为模型,采用四氮唑蓝比色法(MTT法)测定细胞增殖,半定量反转录-聚合酶链反应法检测ECV-304细胞VEGF mRNA表达的变化。结果 当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞有促增殖的作用,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)；当归红芪合剂超滤膜提取物能够诱导VEGF mRNA的表达,其作用与剂量呈正相关。结论 当归红芪合剂超滤膜提取物对EC

2、V-304细胞的促增殖作用机制是通过诱导ECV-304细胞VEGF mRNA表达实现的。 【关键词】 当归；红芪；内皮细胞；血管内皮生长因子 Abstract：Objective To study the effect of the ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture on the VEGF mRNA expression of ECV-304 cell. Method Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixtu

3、re were refined by ultra-filtration technique. ECV-304 cells were cultured as model, and its proliferation was detected by MTT colorimetry. VEGF mRNA expression was observed by semi-quantitative RT-PCR. Results The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys2 / 14s mixtu

4、re could markly promote the growth of ECV-304 cells, there was significant difference between experimental and control group (P0.05). The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture upregulated VEGF mRNA expression with dose-dependent relation. Conclusion The ul

5、tra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture can markly promote ECV-304 cell proliferation, which may be related to the expression of VEGF mRNA.Key words：Angelica sinensis；Hedysarum polybotrys；ECV-304 cell；VEGF当归、红芪是甘肃道地药材,当归有补血活血之功效,红芪又名“多序岩黄芪”,具有补气固表、敛疮生肌功效。当归、黄芪

6、按15配伍所组成的当归补血汤是中医补气生血的经典方,现代药理学研究发现红芪、当归有显著的抗心肌缺血作用。益气生血、补血活血中药的药效是否与促进血管新生有关,当归红芪合剂(15)的有效成分中是否具有促进血管新生的活性成分,本研究对此进行了探讨。1 实验材料1.1 药物与细胞系 红芪购自甘肃宕昌县,当归购自甘肃岷县。人脐静脉内皮细胞(ECV-304),购自中国典型培养物保藏中心。1.2 试剂 DMEM培养基,美国Sigma公司产品。胎牛血清,杭州四季青产品。四氮唑蓝(MTT)试剂、碘化丙啶(PI),华美生物工程公司产品。其他化学试剂均为分析纯,天津化工试剂厂提供。1.3 仪器 5万分子量超滤膜,甘

7、肃省膜科学技术研究所提供。超滤设备,主要组件为海德能公司产品,甘肃省膜科学技术研究所研制。细胞CO2培养箱：SCP-2000型,美国Shill公司产品。流式细胞仪：XL型,美国Coulter公司产品。酶联免疫检测仪：DG-5031型,国营华东电子管厂产品。2 实验方法2.1 药物制备 称取当归饮片500 g、红芪饮片2 500 g,混合,加水浸泡,煎煮后倾出药液,趁热棉花过滤,冷却后上超滤设备。首先陶瓷膜微滤当归浓缩液技术参数为压力0.5 kPa/m3、温度25 、流量100 L/(h·m2)；其次PNA中空纤维超滤膜(截留分子量5万)超滤经微滤处理的红芪、当归配伍的水煎液压力56

8、kg/m3、温度25 、流量100 L/(h·m2)。将5万分子量以下超滤液浓缩至相当于每毫升药液含原药材量为1 g,高压灭菌,冷却后置冰箱(4 )贮藏备用。2.2 细胞培养 采用常规培养ECV-304细胞,培养液为含5%的胎牛血清,青、链霉素各100 U/mL的DMEM,在37 、饱和湿度、5% CO2孵箱中培养,每23 d用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代。2.3 分组 实验分为用药组和对照组：用药组细胞培养液中分别加入不同浓度当归红芪合剂超滤膜提取物,从而形成不同药物浓度培养下的ECV-304细胞；对照组为细胞培养液中加等量的PBS所培养的ECV-304细胞。2.

9、4 细胞增殖率测定 采用MTT法。将ECV-304细胞悬液调整为4×104/mL,接种于96孔培养板,每孔100 L,常规培养24 h细胞贴壁后,实验组分别于细胞培养液中加入当归红芪合剂的超滤膜提取物,并配制成不同浓度；对照组于细胞培养液中加入等量的PBS,调零孔只加等量的细胞培养液无细胞,每组8个复孔,分别于加药后24、48、72、96 h在各孔加入MTT 10 L。继续培养4 h,终止培养,每孔加入150 L二甲基亚砜(DMSO),振荡10 min,用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处的吸光度值(A490),按下式计算细胞增殖率(PR)：PR(A用药/A对照1)×1

10、00%。2.5 反转录-聚合酶链反应法检测血管内皮生长因子mRNA表达 按试剂盒说明提取细胞内总RNA,根据文献1选用特异性引物。VEGF上游引物：5-AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATG-3,VEGF下游引物：5-GCGAATTCCT GCCCGCGCTGAC-3,B-actin上游引物：5-AACACCCAGCCATGTACGTTG-3,B-actin下游引物：5-CGG ATGTCCACGTCACACTTCAT-3。参照文献1略加改进：42 DNA合成45 min,94 预变性4 min,94 预变性45 s,60 退火30 s,72 延伸45 s,循环35次,72 延伸10

11、 min,4 ,上PCR反应仪进行热循环。预计产物长度：VEGF 121为246 bp, VEGF 165为375 bp,B-actin为509 bp。各组取10 L扩增产物溶液加入含0.5 mg/L溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶孔中,同时一孔内加入与0.25%溴酚蓝混匀的Marker作参照。在恒温、电压5 V/cm、恒流75 mA于1×TBE缓冲液中电泳12 h,在凝胶图像成像系统下获得图像,用凝胶图像分析系统分析所获图像上的各条带的光密度,以VEGF 165基因条带的光密度参数与B-actin条带的光密度参数的比值做为该标本mRNA的表达参数。重复上述实验4次。3 统计学方法 用SPS

12、S软件对实验数据进行处理,结果用x±s表示,多组间均数比较用单因素方差分析和q检验。4 结果4.1 当归红芪合剂对ECV-304细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响(见图1、表1)表1 ECV-304细胞在当归红芪合剂超滤膜提取物处理48 h后VEGF mRNA 4.2 当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞增殖的影响(见表2)表2 当归红芪合剂超滤膜提取物作用于ECV-304细胞不同时间细胞增殖率比较(略)从表2可以看出,在1.521.0 g/L浓度范围内,当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞48 h,有显著的促ECV-304细胞增殖的作用。从增殖率看,在7.51

13、5.0 g/L浓度范围,当归红芪合剂超滤膜提取物促ECV-304细胞增殖的作用最强；比较在相同浓度下,当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞24、48、72、96 h的增殖率结果,提示当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞48 h促增殖效果最明显；在3.09.0 g/L浓度范围内,当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞24、48、72 h,均有显著的促ECV-304细胞增殖的作用,并且其最佳作用时间为48 h；当归红芪合剂超滤膜提取物促ECV-304细胞增殖的最大增殖率为44.31%,当归红芪合剂超滤膜提取物的用药范围在1.521.0 g/L。4.3 药物鉴定及制备结果

14、 当归、红芪经甘肃中医学院药学院生药学教研室李成义教授鉴定,分别为伞形科当归属的根和豆科岩黄芪属植物多序黄芪的干燥根茎。实验所用当归红芪合剂5万分子量以下超滤膜提物具有稳定性强、可重复性好的特点。5 讨论本研究利用甘肃省膜科学技术研究所已有技术和设备优势,应用超滤技术对当归红芪合剂进行了精制。超滤技术不需要加热,不需要添加化学试剂,操作条件温和,没有相态变化,具有破坏有效成分的可能性小、能耗少、工艺流程短等优点,近年来正逐渐地被用于中药成分的分离、纯化、精制2。实验过程中所用当归红芪合剂5万分子量以下超滤膜提取物具有稳定性强、实验可重复性好的特点。血管新生的许多关键步骤均需内皮细胞参与,内皮细

15、胞在血管生成中具有非常重要的作用。利用体外培养血管内皮细胞,已广泛应用于血管新生的研究当中,ECV-304细胞具有一般内皮细胞的某些特征,而且还具有可无限传代、不依赖特殊生长因子就能存活等特点3。李氏等4利用ECV-304细胞在体外成功构建血管新生的三维模型,证明ECV-304细胞可用于血管新生的研究,所以本实验以体外培养的内皮细胞株ECV-304细胞为模型。MTT法是检测细胞增殖的经典方法,可间接反映活细胞的数目。本实验结果显示,当归红芪合剂有明显促进ECV-304细胞增殖的作用；应用反转录聚合酶链反应技术分析了当归膜提取物作用ECV-304细胞后VEGF mRNA表达的变化。研究结果表明,

16、当归超滤膜提取物可以诱导VEGF mRNA的表达,说明当归超滤膜提取物可能是通过诱导VEGF mRNA的表达而发挥其促内皮细胞增殖的作用。基于VEGF广泛的生物学效应及内皮细胞的增殖在血管新生中的重要性,提示当归红芪合剂超滤膜提取物中可能存在一些活性物质,具有促血管新生的作用,其作用可能发挥在血管新生的多个环节,而不是仅仅在内皮细胞增殖这一个环节上起作用,这些活性物质可能在一些缺血性疾病中有一定的应用价值。【参考文献】 1 Jian-Wei Zhu, Bao-Ming Yu, Yu-Bao Ji, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor by hydrogen peroxide in human colon cancerJ. World J Gastroenterol,2002,8(1)：153157.2 彭国平,郭立玮,徐丽华,等.超滤技术应用对中药成分的影响J.南京中医药大学学报,2002,18(6)：339341.3 Suda K, Rothen-Rutishauser B, Gunther