实用HPLC方法的建立ppt课件

1、实用HPLC方法的建立目录1 前言2 HPLC方法建立的步骤3 选择仪器类型，确定检测器及其参数2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤1 了解样品的有关情况，明确分析目的7a 回 收 纯 化 物 质8 方 法 论 证 进 入 常 规 实 验 室7b 定 量 校 正7c 定 性 方 法6 检 查 出 现 的 各 种 现 象 和 问 题 (包 括 仪 器 、 样 品 稳 定 性 等 ） 选 择 解 决 办 法 和 特 殊 步 骤5 优 化 分 离 条 件 ， 选 择 最 佳 检 测 器 参 数 、 色 谱 柱 、 流 动 相 比 例 等4 选 择 液 相 色 谱 分 离 类 型 ， 色 谱 柱

2、， 流 动 相 ， 其 他 相 关 条 件 （ 如 波 长 等 ） ， 进 行 预 实 验 ， 估 计 最 佳 条 件2.1 了解样品的有关情况2.2 明确分析目的2.3 样品的预处理与检测2.4 HPLC分析模式2.5 色谱条件2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理2.7 定性和定量方法的建立及论证3 色谱条件的选择3.2 检测器的选择3.3 样品的溶解及预处理3.4 样品的进样量3.5色谱柱的选择及保护与再生3.6 泵的选择3.7 色谱工作站4 分析方法建立的实例改变容量因子 K60/4050/5040/60改变选择性 a62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHM

3、eOHOHTHF4.2 梯度方法的建立梯度的洗脱方式溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）梯度洗脱的可变参数124356789 10 11如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化梯度曲线的变化 凹线梯度曲线的变化 凸线梯度平衡时间的影响一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复梯度平衡时间的影响二）平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。有机污染物的影响一）50ml超

4、纯水的有机物污染状态有机污染物的影响二）“三蒸水有大量的有机污染物不适合梯度分析有机污染物的影响三）典型的“实验室水有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析梯度方法开发实例 - 第一步梯度方法开发实例 - 第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质共两个峰中

5、的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。梯度方法开发实例 - 第五步梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。梯度方法开发实例 - 第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。4.3 色谱柱及pH的影响NHNHOONOHOOHNOOOOHOHNH2尿嘧啶尿嘧啶3-3-丁基吡啶丁基吡啶4-4-苯基丁胺苯基丁胺4-4-苯基丁酸苯基丁酸苯酚苯酚丙基苯丙基苯1,4-1,4-二羟基蒽醌二羟基蒽醌N,N-N,N-二乙基间甲苯酰胺二乙基间甲苯酰胺丁基苯丁基苯* 4-Phenylbuty

6、lamine was not used for testing at pH 2.5* 4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 7苯基苯基aa芘芘1,2:3,4:5,6:7,81,2:3,4:5,6:7,8- -四苯基萘四苯基萘菲菲3,4-c3,4-c并菲并菲HPLC 条件条件 试验试验3Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mm1a碱灭活碱灭活1b非碱灭活非碱灭活1. 尿嘧啶尿嘧啶2. 3-丁基吡啶丁基吡啶3. 苯酚苯酚4. 4-苯基丁酸苯基丁酸5. N,N-二乙基间甲苯酰胺二乙基间甲苯酰胺 (DEE

7、T)6. 1,4二羟基蒽醌二羟基蒽醌7. 丙基苯丙基苯8. 丁基苯丁基苯Column: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm pH 2.5 的色谱图2a碱灭活碱灭活2b非碱灭活非碱灭活pH 7 的色谱图Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mmColumn: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm1. 尿嘧啶尿嘧啶2. 苯酚苯酚3. 4-苯基丁胺苯基丁胺4. N,N-二乙基间甲苯酰胺二乙基间甲苯酰胺5. 3-丁基吡啶丁基吡啶6. 1,4二羟基蒽醌二羟基蒽醌7. 丙基苯丙基苯8. 丁基苯丁基苯pH2.5p

8、H7.01. 1. 丙酮丙酮2. 2. 苯苯aa芘芘 3. 3. 菲菲3,4-c3,4-c并菲并菲 4. 1,2:3,4:5,6:7,8-4. 1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘四苯基萘3a3aPlatinum C18, Platinum C18, 5m, 150 x 4.6mm5m, 150 x 4.6mm3b3bNucleosil C18 AB, Nucleosil C18 AB, 5m, 150 x 4.6mm5m, 150 x 4.6mm3c3cInertsil ODS-2, Inertsil ODS-2, 5m, 150 x 4.5mm5m, 150 x 4.5mm5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断色谱分析中各种图谱现象的判断5.1 5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理Time (min.)5.2 基线漂移上漂和下漂）5.3 倒峰的产生和消除5.