利用比较基因组学筛选粗糙型布鲁氏菌RM57株致弱相关基因

1、利用比较基因组学筛选粗糙型布鲁氏菌 RM57株致弱相关基因布鲁氏菌病是一种严重的人畜共患传染病 , 人、牛、羊、猪、犬等哺乳动物 均可以发生感染而致病 ,动物会发生流产、生殖器官炎症 ,人感染布鲁氏菌病后会 引起波浪热。近年来 , 随着我国家畜饲养量不断增加 ,动物及其产品流通频繁 ,部 分地区布鲁氏菌病呈持续上升势头 , 不仅严重影响畜牧业生产 , 也严重危及人民 身体健康和公共卫生安全。加强对布鲁氏菌病的预防和控制具有重要意义。 目前在发达国家消除布鲁氏 菌病的主要方法是直接扑杀。对于布鲁氏菌病疫情比较严重的中国而言 , 各级政府无力负担过高的扑杀成 本 , 故使用疫苗预防和控制布鲁氏菌病

2、疫情是符合我国国情的唯一手段。布鲁氏 菌根据表型差异可分为光滑型和粗糙型 ,两者在血清学上无交叉反应 , 但却有免 疫交叉保护性。一般感染牛、羊的布鲁氏菌均光滑型 , 布病疫苗基本上也是光滑型 ;因此布病 疫苗免疫往往会干扰临床诊断。 开发粗糙型布鲁氏菌疫苗株一直是研究的布病研 究的热点。美国上世纪 90年代末, 在野生动物上开始使用粗糙型牛种布鲁氏菌疫苗RB51株。但其安全性和免疫保护效果备受争议，且对家养动物的真实效果尚无系 统的研究报道。尤其是 ,RB51 采用利福平诱导而来 , 而利福平是治疗人布鲁氏菌病的特效药,RB51的广泛使用对人的安全带来了潜在危害。本实验室采用粗糙型抗血清和

3、光滑型抗血清交叉诱导并反复筛选的方式 , 将一株羊种布鲁氏菌分离株 (M1981)诱导为粗糙型 , 命名为 RM57。生物学特性研究表明，RM57株是一株毒力稳定、安全性高、免疫效果良好的 粗糙型疫苗株。本实验对引起RM57株粗糙表型的脂多糖完整性进行了鉴定，同时 根据国内外报道的可能引起布鲁氏菌粗糙表型的相关基因进行了基因完整性鉴 定以及转录水平变化的测定。结果表明粗糙型RM57株与其亲本光滑型M1981株的脂多糖确实存在差异, 但是已经报道过的脂多糖相关基因均完整存在且无转录水平的变化。 故必然存在 未知的基因参与了布鲁氏菌LPS生物学合成过程或存在某种调节机制控制着布 鲁氏菌LPS合成系

4、统。粗糙型羊种布鲁氏菌RM57株及其亲本光滑型布鲁氏菌 M1981株遗传背景清 晰，均来自于同一母本菌株，这为我们通过基因组学研究布鲁氏菌 LPS合成机制 提供了宝贵的优良素材。本研究以粗糙型羊种布鲁氏菌RM57株及其亲本光滑型布鲁氏菌M1981株为切入点，通过系统的比较基因组学分析，将拓宽人们对于布 鲁氏菌LPS合成的认知。通过二代高通量测序技术对粗糙型羊种布鲁氏菌RM57株及其亲本光滑型布鲁氏菌M1981株的全基因组序列进行了测定,然后对获得的基因组草图序列补缺 口并获得了两株菌的基因组完整序列。 通过基因预测、 重复序列预测等方法获取 两株菌的基因组组成信息 ,对包括基因组所含有基因数量

5、、基因平均长度、串联 重复序列、小卫星序列以及微卫星序列等基因组结构信息进行了解析。对布鲁氏菌基因组进行ORFs预测并通过基因注释、基因功能分类、毒力基 因预测等 , 最终绘制了基因组精细图。 根据布鲁氏菌基因组信息 , 挖掘了与病原菌 生长、代谢相关的基因 , 构建了布鲁氏菌的代谢通路 , 一共包括 22大门类:染色体 结构和动力学、能量产生及传递、细胞周期调控、细胞分裂、染色体分离、氨基酸转运和代谢、核酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、辅酶转运和代谢、脂 类转运和代谢、翻译、核糖体结构和生物发生、转录、复制、重组和修饰、细胞 壁/ 细胞膜生物发生、细胞活性、翻译后修饰、蛋白翻转、伴侣、无

6、机离子转运 和代谢、次生代谢物生物合成、转运和代谢、只有一般功能预测、未知功能、信 号传递机制、细胞间运输、分泌物和囊泡运动、防御机制、胞外结构。根据布鲁氏菌基因组信息 , 挖掘了与毒力因子相关的基因 , 包括: 尿素酶辅助蛋白、尿素酰胺水解酶、尿素酰胺水解酶、铁HI、ABC专运蛋白,ATP结合蛋白、 环状B 1-2葡聚糖合成酶、血红素出口蛋白、磷酸葡萄糖变位酶、假定蛋白Rv0981、 内肽酶Clp ATP结合链C ABC转运蛋白的可能的ATP结合组分、ABC专运蛋白 的可能的ATP结合组分、icl/ace A、脂多糖生物合成蛋白、溶血素 B ATP依赖 性蛋白酶、双组分响应调节器、ATP依赖

7、性Clp蛋白酶蛋白水解亚基、UDP葡萄 糖4-差向异构酶、具有Pho Q的双组分调节系统中的应答调节因子，转录低Mg2+ 浓度表达的基因、sod B超氧化物歧化酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-1-磷 酸鸟苷酰转移酶、man B-磷酸甘露糖变性酶、甘露糖基转移酶、perosamine合成酶、GDP甘露糖4,6-脱水酶/GDP-4-氨基-4,6-二脱氧-D-甘露糖甲酰转移酶、 脂多糖生物合成蛋白、 pan C、 4'-磷酸泛酰乙酰转移酶、 2,3-二氢-2,3- 二羟基 苯甲酸脱氢酶、Isochorismatase、肠杆菌素合成酶组分 E、等离子体合成酶、Mg2+专运蛋白、mgt C、

8、ATPase Vir B11同系物、通道蛋白 Vir B10同系物、通 道蛋白 Vir B9 同源物、 Vir B8 、通道蛋白 Vir B6 同系物、 Vir B5 、 ATPase Vir B4同系物、Vir B3、Vir B2、附着介导蛋白Vir B1同源物、UDP葡萄糖焦磷酸 化酶、Kps F蛋白、鞭毛马达开关蛋白、III型分泌系统ATP酶、鞭毛基底杆蛋白、鞭毛基底杆蛋白、鞭毛P蛋白前体、鞭毛生物合成蛋白、葡萄糖/半乳糖转 运蛋白、Hsp60,60K热休克蛋白、nar H、nar G、磷酸甘露糖异构酶/鸟苷5'-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶、GDP岩藻糖合成酶、GDP甘露糖4,6-脱水酶、ferric enterobactin 转运ATP结合蛋白、Gifsy-2原噬菌体：超氧化物歧化酶前 体Cu-Zn、ahp C内膜ABC转运体、推定型III型分泌蛋白。以粗糙型羊