感受态细胞的制备步骤和原理

1、精品文档感受态细胞的制备步骤和原理实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质 粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细 胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖, 就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本 原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3mI LB（无抗生素）培养基中，37°C, 180rpm培养过夜。让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态 细胞。2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB （无抗生素）培养基中，37°

2、;C250rpm 大约 2.5 小时。减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10mi n, 4000rpm 4°C离心10min,弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管 倒过来）使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基 了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。4菌体重悬于10mL 10OmmoI/L冰冷CaCI2中，轻吹，4°C 30min, 4000rpm 离心 5min 弃上清。细菌处于0度，CaCI2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形， 外源DNA形成抗DNA酶的務基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞 表面

3、（務基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA）,经短时 间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹， 这时细胞壁打开，十分脆弱）5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCI2中，轻吹，用于 转化。除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。 防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细 胞壁打开，十分脆弱）6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒，冰浴30min 受体菌：感受态细胞100uL,加入2uL无菌双蒸水阴性对照：0. 1mol/LCaCI2溶液100uL,加入2 uL阴性对照第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二 个阴性对

4、照是为了验证CaCI2溶液和pET-21a质粒未被污 染。冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。7热激42度，90s【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min9加入800 uL无抗生素的LB, 37°C复苏【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒 表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有 抗生素的LB平板上生长。】10 取 100ul 细胞直接在含 50ug/mL Carben i c i I I i n 西 林）的LB培养基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至 液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。 在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落 的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功 的菌落。用竣节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以 可以降低卫星菌落的数量。因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫）, 加入抗生素。】如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！24U75 5D» 34M5*33 対 K25? 口67$A臼 «22«1