《荧光定量PCR》ppt课件

1、实时荧光定量PCR技术的原理及运用 (Real time Quantitative PCR)原理 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参与非特异性的荧光染料如： SYBR GREEN I 或特异性的荧光探针如： Taqman 探针，实时检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的荧光信号阈值时所需的循环次数： CT 值 Cycle Threshold ； 经过将知浓度规范品的 CT 值与其浓度的对数绘制规范曲线，就可以准确定量样品的浓度。荧光定量 PCR 技术具有简便、快捷的优点，可以有效扩增低拷贝的靶片段 DNA ，对每克样品中 20pg-10ng 的转基因成分进展有效检测。引物设计原那么：

2、 1.上下游引物要保守为了可以扩增出所需求的保守片段，必需对保守的100-200片段进展PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。2.上下游引物的长度普通为18-30bp之间，且Tm值在58-62之间，上下游引物的Tm值相差最好不超越2。3.确保引物中GC含量在30-80%。应防止引物中多个反复的碱基出现，尤其是要防止4个或超越4个的G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。4.防止引物内出现反向反复序列构成发夹二级构造，同时也应防止引物间配对构成引物二聚体。5跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。什么是探针：生物方面生物方面探针是一小段单链探

3、针是一小段单链DNADNA或者或者RNARNA片段大约是片段大约是2020到到500bp500bp， 用于检测与其互补的核酸序列。双链用于检测与其互补的核酸序列。双链DNADNA加热变性成为单链，加热变性成为单链，随后用放射性同位素通常用磷随后用放射性同位素通常用磷-32-32、萤光染料或者酶如、萤光染料或者酶如辣根过氧化物酶标志成为探针。磷辣根过氧化物酶标志成为探针。磷-32-32通常被掺入组成通常被掺入组成DNADNA的的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。共价键相连。 当将探针与样品杂交时，探针和与其互补

4、的核酸当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸DNADNA或或RNARNA序列经过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被序列经过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据探针的种类，可进展放射自显影、萤光显微洗去。最后，根据探针的种类，可进展放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判别样品中能否，或者何位置含有被测镜、酶联放大等方法来判别样品中能否，或者何位置含有被测序列即与探针互补的序列。序列即与探针互补的序列。探针设计原那么1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依托探针来决议。实际上有一个碱基不配对，就能够检测不出来。2. Taqman探针的长度最好在25-32bp

5、之间，且Tm值在68-72之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。3. 确保探针中GC含量在30-80%。4. 防止探针中多个反复的碱基出现，尤其是要防止4个或超越4个的G碱基5. 探针的5端不能为G，由于即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。6. Taqman探针应接近上游引物，即Taqman探针应接近与其在同一条链上的 上游引物。两者的间隔最好是探针的5端离上游引物的3有一个碱基。7. 防止探针与引物之间构成二级构造。8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。2、TaqMan探针法TaqMan作用机理作用机理TaqMan法优缺陷基因表达绝对定量、相对定量 基因表达的相对绝对定量绝对定量是用知的规范 曲线来推算未知样本的量，将规范品稀释至不同浓度，作为模板 进展PCR反响。以规范品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的 C t值为纵坐标，绘制规范曲线，对未知样品进展定量时，