莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡及Bcl2表达的影响

1、莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡及Bcl-2表达的影响作者：杨美春,方刚,李林,覃振林,钟振国,杨思源,汤红丽【摘要】 目的 观察莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡指数及Bcl-2表达的影响,探讨莪术油注射液致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡的机制。方法 以不同浓度莪术油注射液作用人卵巢癌SKOV3细胞后,通过荧光显微镜观察细胞核变化、透射电镜计算细胞胀亡指数、琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA断裂情况、免疫组化观察细胞Bcl-2基因的表达。结果 人卵巢癌SKOV3细胞经莪术油注射液作用48 h后,荧光显微镜观察到胀亡细胞出现细胞肿胀,体积增大,胞膜面积缩小,核染色质分散扩大；细胞胀亡指数随

2、浓度的增加而增大,呈量效关系；电泳观察DNA呈弥漫型；Bcl-2基因表达下调。结论 莪术油注射液可使人卵巢癌SKOV3细胞随浓度的增加而胀亡指数增大,并可下调Bcl-2基因表达,提示下调Bcl-2基因表达可能是莪术油注射液致SKOV3细胞胀亡的作用机制之一。 【关键词】 莪术油注射液；人卵巢癌SKOV3细胞；胀亡指数；Bcl-2 Abstract：Objective To discuss the impact of zedoary turmerie oil (ZTO) injection over oncosis index and Bcl-2 expression of human ovar

3、ian cancer SKOV3 cell. Methods After ZTO injection acted on human ovarian cancer SKOV3 cells, the changes in the nucleus were observed by fluorescence microscope, oncosis index was counted by projection electron microscope, the situation of cell DNA breakage was observed by agarose gel electrophores

4、is, and cell Bcl-2 gene expression was observed by immunohistochemical method. Results After treated by ZTO injection for 48 hours, human ovarian cancer SKOV3 cells shows that oncosis cell was swelling in fluorescence microscope, the volume increased, the membrane area narrowed, the nuclear chromati

5、n expansed. The oncosis index increased with dose-effect relationship, DNA electrophoresis showed diffuse type and Bcl-2 gene expression was down-regulated. Conclusion ZTO injection can increase oncosis index of human ovarian cancer SKOV3 cell with the concentration, and lower Bcl-2 gene expression,

6、 which may be one of the mechanisms of ZTO injection caused oncosis of SKOV3 cell.2 / 12 Key words：zedoary tumerie oil injection；human ovarian cancer SKOV3 cell；oncosis index；Bcl-2 我们在前期的实验研究中发现,莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞有明显的抑制作用,并且能导致SKOV3细胞出现胀亡现象1-2。本实验通过观察细胞核的形态变化、计算细胞胀亡指数、细胞DNA断裂情况、检测细胞Bcl-2的表达来进一步探讨其作用

7、机制。1 实验材料人卵巢癌SKOV3细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所,广西肿瘤防治研究所临床中心实验室传代保存。细胞用含有10%灭活小牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素的RPMI-1640培养液于37 、5%CO2条件下培养。荧光显微镜为美国产,电泳仪为日本产,H-500日立透射电镜,Bcl-2 SP法免疫组化的试剂盒(福州迈新公司),RPMI-1640和小牛血清为Gibco公司产品,其余均为国产分析纯试剂。莪术油注射液购自黑龙江瑞格制药有限公司(批号051101,国药准字：H20023314)。2 实验方法2.1 荧光显微镜观察 选择浓度为31.25、62.5、125 g

8、/mL的莪术油注射液进行实验1。用6孔细胞培养板培养细胞,预先将小盖玻片放置于培养板底部,调整细胞密度至1.0×104个/mL,每孔2 mL。置于培养箱内培养,至对数生长期,更换培养液,加入药物。实验组加入终浓度分别为31.25、62.5、125 g/mL的莪术油注射液,同时以RPMI-1640培养液作为空白对照组,48 h后取出盖玻片,PBS洗涤,加入吖啶橙储存液(10 mg/L)5 L,在氯化钙介质中染色,荧光显微镜观察,摄片。2.2 透射电镜观察计数胀亡细胞指数 参照文献3方法并改进。选择浓度为31.25、62.5、125 g/mL的莪术油注射液进行实验,每个浓度制作10个标本

9、。按照上述浓度接种于细胞培养瓶中,作用48 h后,收集细胞,清洗后1%锇酸固定,0.1%PBS清洗,常规脱水,浸透,环氧树脂包埋,切成超薄切片,透射电子显微镜观察计数胀亡细胞,并计算细胞胀亡指数。2.3 琼脂糖凝胶电泳细胞DNA断裂情况 经31.25、55.16、62.5、125 g/mL浓度的莪术油注射液作用48 h后,收集细胞,用PBS洗涤数次,加入0.5 mL细胞裂解液, 10 L蛋白酶K(20 g/L)置37 水浴中过夜,用等体积的饱和酚萃取,10 000 r/min离心,取上层,加入等体积的氯仿-异戊醇(241)除蛋白,10 000 r/min离心10 min,取上清液,加入3倍体积

10、的无水乙醇、1/10体积的的醋酸钠(3 mol/L),置-20 20 min,取出离心,沉淀用体积分数为70%乙醇洗涤2次,空气干燥。加入200 L TE溶解,RNase酶2 L(10 g/L)反应30 min(37 )。取上述样品20 L,在2%琼脂糖凝胶电泳,75 V,1.5 h,摄像。2.4 免疫细胞化学法检测Bcl-2基因的表达 参考文献4方法,取对数生长期的SKOV3,调整细胞浓度1.0×104个细胞/mL,接种至内铺玻片的12孔培养板内,置于37 、5% CO2孵育箱内培养24 h后,加入终浓度为55.16 g/mL (莪术油注射液作用SKOV3 48 h后其IC5055

11、.16 g/mL2)浓度的药物,并设对照组(仅加培养基),每孔液体体积为2 mL。继续培养48 h后,取出玻片,PBS洗5 min×3次,95%酒精固定20 min,严格按试剂盒说明书操作,以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：排除爬片中间细胞,10×10低倍镜下随机选取10个细胞分布均匀的视野,10×20中倍镜下随机计数50个细胞视野。按着色强弱分为4个等级：无着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分(抗体阳性部位均在胞浆)。按公式HSCOREPi(i+1)(i0,1,2,3；Pi表示评分为i的比例)计算HSCORE得分5。该评分方法考虑到了单个细胞是否阳性

12、及其强弱,更具体真实地反映细胞的蛋白表达情况。3 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行统计学处理,所有数据以x±s表示,细胞胀亡指数行单因素方差分析,Bcl-2的表达比较行t检验。4 结果4.1 荧光显微镜观察结果 吖啶橙染色后,荧光显微镜观察,空白对照组SKOV3细胞呈均匀荧光染色,而细胞经不同浓度莪术油注射液的作用48 h后,主要变化为细胞肿胀,体积增大,胞膜面积缩小,核染色质分散扩大,尤其在125 g/mL浓度可见明显的肿胀细胞,胞浆染色极不明显,未发现明显的凋亡细胞(即细胞核或细胞质内出现致密浓染颗粒状荧光)。4.2 胀亡指数(见表1)表1 SKOV3细胞胀亡指数比较(略

13、)注：与空白组比较,*P0.05,*P0.01；与莪术油注射液中剂量组比较,#P0.01；与莪术油注射液低剂量组比较,P0.014.3 免疫细胞化学法检测Bcl-2基因表达结果 经免疫组化染色后的切片,阳性细胞呈现棕黄色或棕褐色染色。细胞Bcl-2表达的HSCORE得分见表2。表2 SKOV3细胞Bcl-2表达的HSCORE得分比较(略)注：与空白组比较,*P0.014.4 DNA琼脂糖凝胶电泳结果 经不同浓度莪术油注射液处理后, SKOV3细胞DNA条带均呈弥漫型,琼脂糖电泳未出现典型的凋亡梯度状条带。见图1。5 讨论 细胞胀亡是由多基因调控的被动死亡的过程,在形态学及生物学特征上明显不同于

14、细胞凋亡。目前研究表明,异常细胞胀亡与肿瘤发生发展有极密切的关系,可通过导致细胞胀亡来发挥抗肿瘤作用6。目前标志细胞胀亡的指标很多,除了透射电镜观察以外,琼脂糖凝胶电泳也可证明胀亡的存在。由于CAD(caspase activated DNase)7的作用,胀亡细胞DNA内的核小体为弥漫性随机碎片,经电泳后呈随机性电泳条带,区别于凋亡细胞的阶梯状条带。在细胞胀亡的调节中,Bcl-2发挥了作用,有研究发现胀亡细胞中的Bcl-2基因表达常下调8。 本课题主要研究莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞胀亡指数、Bal-2基因表达等的影响。按照现行常用的透射电镜计数胀亡细胞,多参照Hein S等2提出的

15、要求底数为1 000个肿瘤细胞,但是本实验细胞培养所收集的每份肿瘤细胞制作成超薄切片后观察计数,每张切片一般不超过500个细胞。因此,本实验每个标本只计算1个胀亡指数。实验结果表明,莪术油注射液作用SKOV3细胞后,其细胞胀亡指数随浓度的增加而增大,呈现一定的量效关系(P0.01)。荧光显微镜观察到胀亡细胞出现细胞肿胀,体积增大,胞膜面积缩小,核染色质分散扩大；电泳观察DNA呈弥漫型条带；免疫组化提示,莪术油注射液导致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡与下调Bcl-2基因表达有关。 总之,莪术油注射液致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡随浓度的增加胀亡指数增大,并且可下调Bcl-2基因表达,提示下调Bcl-2

16、基因表达是莪术油注射液致SKOV3细胞胀亡的作用机制之一。 致谢：对广西医科大学医学实验中心黎丹戎教授、广西中医学院病理教研室王进声老师等在实验过程中的指导和大力协助深表感谢。【参考文献】 1 杨美春,方 刚,张奕梅,等.莪术油注射液致人卵巢癌SKOV3细胞胀亡形态变化的研究J.实用药物与临床,2009,12(1)：13.2 杨美春,方 刚,钟振国,等.莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞体外生长的影响J.时珍国医国药,2009,20(3)：603604.3 Hein S, Amon E, Kostin S, et a1. Progression from compensated hypert

17、rophy to failure in the pressure overloaded human heart：structural deterioration and compensatory mechanismsJ. Circulation, 2003,107(7)：984991.4 陈小芬,汤为学,李龙江.姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3的抗增殖作用J.重庆医科大学学报,2005,30(2)：256259.5 Harrington DJ, Lessey BA, Rai V, et al. Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosisJ. J Pathol,1999, 187(2)：242248.6 曹献英,张 珠,张 然,等.磷灰石纳米粒子体外致肝癌细胞的胀亡J.中国肿瘤,2003,12(6)：248350.7 Zhao K, Zhao GM, Wu D, et a1. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling,