乳鼠心成纤维细胞波形蛋白和线粒体表达的激光扫描共聚焦显微镜观察

1、乳鼠心成纤维细胞波形蛋白和线粒体表达的激光扫描共聚焦显微镜观察 作者：王春梅郭海涛杨家冀黄晓峰陈丹朱妙章 【关键词】 成纤维细胞 关键词: 成纤维细胞;细胞骨架;线粒体;激光扫描共聚焦显微镜;大鼠 摘 要:目的 用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察培养的乳鼠心成纤维细胞中细胞骨架波形蛋白（vimentun，Vim）、线粒体（mitochondrial，Mi）以及相互关系. 方法 分离纯化乳鼠心成纤维细胞，免疫荧光双标记技术进行了Vim和Mi的标记，激光扫描共聚焦显微镜观察. 结果 培养的乳鼠心成纤维细胞中Vim位于细胞的胞质中，呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，标记明显，许多细丝交织形成网状

2、结构.Mi标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，Mi的颗粒大小不等，形态不一，可聚集成团，并有明显的沿着Vim分布的趋势. 结论 LSCM观察培养的心成纤维细胞中Vim呈细丝交织形成立体的网状结构，Mi有沿着细胞骨架Vim分布的趋势. Keywords:fibroblasts;cytoskeleton;mitochondrion;laser scanning confocal microscope;rats 1 / 9Abstract:AIM To observe the vimentin（Vim），mitochon-drion（Mi）and their interrelationships in

3、 the cultured cardiac fibroblast of rat with laser scanning confocal microscope.METHODS The cardiac fibroblasts of rat underwent double labeling of Vim and Mi by immunofluorescence technique after isolation and purification，then were observed with laserscanning confocal microscope.RESULTS Vim was ob

4、served in the cytoplasm of cardiac fibroblast of rat clearly，with a distribution of irregular green lines or fila.Most of them dis-played reticular formation.Mi were the red granules，which were universally distributed in the cytoplasm.The size and shape were irregular，either gathered in a mass or di

5、stributed along Vim.CONCLUSION Laser scanning confocal micro-scopic observation reveals that Vim is filament-like and can display reticular formation and Mi might be distributed along Vim. 0 引言 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）已广泛应用于生物医学的各个领域1，2 .但是对于心成纤维细胞中细胞骨架观察未见报道.了解心成纤维细胞增殖和功能

6、的变化特征，尤其是细胞骨架的分布与变化及与能量供给单位-线粒体的关系，对采取及时的防治措施是十分重要的3 .我们采用免疫荧光双标记技术对培养的心成纤维细胞进行了波形蛋白（vimentun，Vim）和线粒体（mitochondrial，Mi）的标记，用激光扫描共聚焦显微镜观察了形态和分布以及相互的关系.旨在探讨正常培养的心成纤维细胞中Vim和Mi的定性、定位，以及相互的关系，为进一步研究心成纤维细胞的病理变化提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 SD乳鼠（12d）:由第四军医大学实验动物中心提供.胰酶:Difco，胶原酶:EDTA，DMEM培养基及小牛血清:Gibco;线粒体标记物Mit

7、o-Tracker（Gene Co Ltd110000），波形蛋白标记物（Dako Vimentun150），羊抗小鼠IgG-FITC. 1.2 方法 心成纤维细胞培养与鉴定与郭海涛等4 方法相同.将载有心成纤维细胞的盖玻片pH7.4的PBS（37）冲洗12min3次，加入MitoTracker（37）1545min，pH7.4的PBS冲洗3次，用4丙酮固定1015min.pH7.4的PBS冲洗3次，加鼠抗波形蛋白4560min37或4过夜.pH7.4的PBS洗3次，加FITC标记的羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程公司，稀释度150）37孵育4560min或4过夜.pH7.4的PBS洗3次，

8、无荧光缓冲甘油封片.对照用无关抗体以及正常兔血清取代一抗染色作为抗体特异性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照.所用LSCM型号为Bio-Rad MRC-1024，用于FITC的激发波长为488nm，568nm用于激发Mi.用于图像采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar40×油浸镜，数值孔径（NA）为1.3.图像存为512×512相素类型.ZOOM设为1.0.若需要更大的放大倍数时，可以选择更大的ZOOM范围.扫描所用的激发值依据样本的不同可以在共聚焦系统提供的梯级值中选择. 2 结果 2.1 心成纤维细胞波形蛋白 呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，

9、标记明显，位于细胞的胞质中，单个细胞的许多细丝交织形成网状结构（Fig1）. 2.2 心成纤维细胞线粒体 标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，线粒体的颗粒大小不等，形态不一，可聚集成团（Fig2）. 2.3 波形蛋白与线粒体双标记 线粒体有明显的沿着细胞骨架波形蛋白分布的趋势，局部可见到大小不等，形状不规则的团块，为波形蛋白绿色线条状细丝与红色颗粒在重叠处为黄色斑块状（Fig3）. 图1 图3 略 3 讨论 心脏是人体的重要器官，由心肌细胞和几种非心肌细胞（成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞）构成，非心肌细胞占心脏细胞总数的三分之二，其中90%以上是成纤维细胞.虽然婴儿出生后心肌细胞立即丧失增殖能

10、力，但是，非心肌细胞仍然增殖，甚至在成人心脏仍有增殖的报道 5，6 .心脏受损发生病理改变，可导致心成纤维细胞增殖.Vim是细胞骨架纤维蛋白之一，属中间丝蛋白，是细胞早期增殖、分化的标志之一，同时在保持细胞形态和位置方面有很大的作用.转录活跃的心成纤维细胞中细胞骨架与功能相适应，非正常的增殖和胶原合成的增加是高血压和心肌梗死后心室重朔、心肌肥大及纤维化等心血管病理过程的重要环节.因此了解心成纤维细胞增殖和功能的变化特征，尤其是细胞骨架的分布与变化及与能量供给单位-线粒体的关系，对采取及时的防治措施是十分重要的. 线粒体作为一个重要的细胞器普遍存在于几乎所有的真核细胞中（除外成熟红细胞），其主要

11、的代谢功能是进行氧化磷酸化为细胞提供能量，是细胞呼吸代谢中心和细胞内ATP的主要源泉，与细胞的生命活动有着非常密切的关系.线粒体的形状、数目、大小和功能随环境发生变化，在细胞发育过程中，线粒体是能够最早反映细胞分化趋势的细胞器之一.在分化趋势旺盛和功能活跃的细胞中线粒体明显增多. 本实验采用免疫荧光双标记技术对培养的乳鼠正常心成纤维细胞进行的Vim和Mi标记，LSCM观察结果表明，心成纤维细胞Vim位于细胞的胞质中，呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，标记明显，单个细胞的许多细丝交织形成网状结构.Mi标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，Mi的颗粒大小不等，形态不一，有明显的沿着细胞骨架Vim分布的

12、趋势，可以推测与细胞运动中的能量供给有关.心成纤维细胞的Vim病理性增殖变化以及与Mi的分布关系有待进一步研究. 参考文献: 1Wang CM，Huang XF，Pan BR，Dai XW，Ma FC，Zao YL.Ex-pression of chromogranin C/secretograninand pancreastatin in pancreatic ductal carcinoma J.Shijie Huaren Xiaohua Za-zhi（World Chin J Digestol），1998;6（6）:470-473. 2Wang CM，Huang XF，Yang JJ，H

13、uang M，Li XD，Chen D.Coexistence of adrenocorticotropin and secretograninin the rat pituitary gland after brain injury J.Shenjing Jiepou Zazhi（Chin J Neuroanatomy），2000;16（4）:337-340. 3Zhu YZ.Distribution of vimentin in normal and cardiac mutant axolotl embryonic hearts by confocal laser scanning microscopy J.Jiepouxue Zazhi（Chin J Anatomy），1999;22（5）:423-425. 4Guo HT，Zhu MZ.Vasonatrin peptide attenuates hypoxia-in-duced expression in Ca2+ I of cultured rat cardiac fibroblasts J.Acta Physiol Sinica，2001;53（4）:286-290. 5Kim Ho-dirk.Ex