人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达

1、人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达 作者：姜立 马文丽 柯杰兵 彭翼飞 李晋 徐兵 郑文岭 【摘要】 目的 构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法 采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果 重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45 900左右出

2、现新的蛋白条带。结论 成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。 【关键词】 鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达 鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的关键酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步鸟氨酸向腐胺的转变。随后，腐胺再转变为亚精胺、精胺。ODC是该代谢途径的限速酶，在此过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme,OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接

3、到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色13。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度

4、保守的ORF2产物的组合。在OAZ mRNA的阅读框中，需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的52 / 13端终止密码子处，通常序列为TGCTCCTGATGCC(196208)。翻译框架达到TGA时，如果没有精胺的存在，核糖体将接受TGA为终止密码子，翻译到此终止。当精胺浓度一定时，核糖体的翻译即可受到精胺的调控进行+1移码，跃过终止密码子TGA上的T，以GAT指导的天冬氨酸为后续，翻译合成ORF24-5。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控，表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性，反向调节细胞内多聚胺的水平，从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中，普遍发现了ODC的

5、高表达，因此，OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能，就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导，缺乏精胺时，核糖体将不能进行+1的移位，翻译完整的全长OAZ蛋白。为此，本研究对OAZ基因进行了特定T碱基的缺失突变，成功构建至表达载体pET-32a中，测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白，将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备，具有重要意义。 1 材料和方法 1.1 试剂 大肠杆菌DH5、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。Qui

6、kChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、Xho和EcoR内切酶均购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。 引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。 P1：5-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3；P2：5-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3。 1.2 方法 1.2.1 反向PCR扩增 以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR 反应: 将pET-32a-OAZ-wild质粒(10 mg/L) 1 l、

7、dNTP 1 l、10×Buffer 5 l、P1与P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 l、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 l、双蒸馏水37 l 加入PCR 管; 95预变性30 s后， 95 30 s、55 1 min、68 6 min ，共 18个循环。PCR 产物置于冰上2 min , 加入1.5 l Dpn内切酶(106 U/L), 37 水浴2 h，酶解模板DNA。 1.2.2 转化大肠杆菌DH5 取感受态大肠杆菌50 l, 加入上述Dpn处理液10 l, 轻轻混匀, 冰浴30 min 42热休克45 s 冰上2 min，加

8、入预热的LB 培养液0.5 ml, 置于37恒温摇床中, 200 r/min 振摇1 h。 1.2.3 质粒扩增、提取及鉴定 取200 l 菌液铺到LB 琼脂培养板( 含Amp) 上, 37培养1216 h。挑取单菌落,提取质粒。取质粒5 l, 选取插入片段两端的酶切位点Xho和EcoR 双酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后，命名为pET-32a-OAZ-mutation。 1.2.4 重组蛋白表达 将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌，铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后，接种至含5 ml LB培养基中（含氨

9、苄青霉素）振培过夜。次晨取100 l接种至新的5 ml LB培养基中，37振培34 h，至D值约为0.6时，加入异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mmol/L，继续培养2 h和4 h后取菌液1 ml，进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。 2 结 果 2.1 pET-32a-OAZ-mutation测序图 PCR扩增后，Dpn酶切产物并转化大肠杆菌DH5，挑取阳性克隆，鉴定含有目的基因后，抽提质粒，以T7启动子序列为测序引物序列于ABI3730测序仪进行DNA序列测定，确定OAZ基因的TGCT

10、CCTGATGCC(196208)处的202位T已缺失，其余序列没有变化(测序图中的第312323号序列为TGCTCC GATGCC，显示T已缺失)。见图1。 2.2 重组pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表达 SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的含重组质粒BL21与对照菌相比，在相对分子质量为45 900位置上出现1条新带。见图2。图1 T7启动子测序结果图 图2 表达产物SDS-PAGE图 MMarker；1BL21菌；2转化pET-32a质粒的BL21菌；3转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后2 h；4转化

11、pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后4 h 3 讨 论 细胞的生命活动需要多聚胺(polyamine)类物质，包括腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺几乎是所有活细胞的必要组分，它们的缺失将导致细胞生长减少甚至死亡，但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡6-7。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达除了能降低细胞内多胺水平，还能抑制细胞的生长。而OAZ能够特异地拮抗ODC的催化活性，减少细胞内多胺的生成，因此成为研究抑制肿瘤细胞恶性增殖的切入点8。 从最初哺乳类动物细胞中克隆出OAZ基

12、因至今，已陆续发现有OAZ1、OAZ2和精子特异性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所说的OAZ基因，其表达的蛋白产物对于ODC有特异性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ与ODC结合后，通过26S蛋白酶降解ODC，是一种在翻译后水平调节酶活性的机制。ODC是一个二聚体酶，亚基间的聚合与解聚非常迅速。OAZ对于ODC单体蛋白有非常高的亲和力，形成AZODC的蛋白聚合体，促进ODC被26S蛋白酶降解711。人OAZ蛋白是由两段ORF的表达框所翻译表达，在第一个表达框的终止密码子处，有一个核糖体移位位点，在精胺诱导下，出现程序性的阅读框的移位。越过终止密码子，继续住下

13、游翻译，直至第2个表达框的终止密码子处。全部蛋白共由228个氨基酸所组成，其中ORF1编码N末端68个氨基酸，ORF2编码C末端160个氨基酸。ORF2编码的C末端氨基酸序列是真正发挥抗酶活性的肽链区段，但是该区段的蛋白表达需要在精胺的诱导下才能出现，因此增加了对于OAZ全长蛋白调控机制的研究难度。 故此，本研究通过定点突变技术，成功地使OAZ基因ORF1与ORF2间的核糖体移位位点发生缺失，也就是使ORF1的终止密码子的TCCTGATGCC的T发生缺失，使核糖体按照随后GAT GCC的三联体顺序进行翻译，无需精胺的诱导即可表达出完整的OAZ蛋白。由于选用质粒pET-32a作为原核表达载体，O

14、AZ蛋白表达的同时，还在其C末端携带有多聚组氨酸的标签，可通过His标签蛋白进行纯化，为进一步研究其在肿瘤细胞中的调控机制提供了条件，为开发其临床应用奠定了基础。 【参考文献】 1 Schipper RG, Cuijpers VM, De Groot LH, et al. Intracellular localization of ornithine decarboxylase and its regulatory protein, antizyme-1J. J Histochem Cytochem, 2004,52(10):1259-1266. 2 Mangold U. The antizy

15、me family: polyamines and beyondJ. IUBMB Life, 2005,57(10):671-676. 3 Newman RM, Mobascher A, Mangold U, et al. Antizyme targets cyclin D1 for degradation. A novel mechanism for cell growth repressionJ. J Biol Chem,2004,279(40):41504-41511. 4 Schenkel H, Hanke S, Cecilia De Lorenzo， et al. P element

16、s inserted in the vicinity of or within the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3 J. Genetics, 2002, 161(2):763-722. 5 Gerner E, Meyskens F Jr. Polyamines and cancer: old molecules, new understandingJ. Na

17、t Rev Cancer, 2004,4(10):781-792. 6 Fong LY, Feith DJ, Pegg AE, et al. Antizyme overexpression in transgenic mice reduces cell proliferation, increases apoptosis, and reduces N-nitrosomethylbenzylamine-induced forestomach carcinogenesis J. Cancer Res,2003,63(14):3945-3954. 7 Sakata K, Kashiwagi K, I

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