单克隆抗体的制备

1、单克隆抗体的制备目的：了解抗体的概念，化学结构，单克隆抗体的概念，单克隆 抗体的制备流程及其注意事项，单克隆抗体和多克隆抗 体的区别在ELISA实验中，抗体直接影响决定测定的质量（如特异性，灵敏度，精密度和准确性），因此，了解抗体的性质，制 备优质的抗体是建立ELISA实验的基本条件。一抗体的概念，分类及性质1抗体（Antiboday简写为Ab）是动物机体的果些活性细胞在 某些物质的（抗原）的刺激下产生的，并能与这与这些物质特 异性结合的一类活性物质。（必须掌握）2哺乳动物的抗体主要是分布于体液中，尤其是血清中，因此抗 体的另一个说法叫做抗血清。（必须掌握）3抗体的分类：（了解其他的分类方式，

2、掌握单克隆抗体和多克隆抗体的分类） 异嗜抗体|:某些抗体除了和相应的抗原发生结合反应,还可与无 血缘的关系的抗原发生反应，如豚鼠组织免疫家兔，制得抗体 在补体的参予下能溶解绵羊红细胞。异种抗体|：免疫原免疫的动物在分类学上不属于同一种，这样制 备的抗体为异种抗体。自身抗体|：机体在某种条件下对自身组织产生的抗体。I同种抗体I：同种动物不同的个体Z间，其组织成分的结构也有差异，用这些组织成分刺激同种属的另一个体产生的抗体 免疫抗体|:经人工免疫，预防接种，感染或自然接触某些抗原物 质所产生的抗体。天然抗体|:没有明显的抗原物质刺激即天然存在于体液屮的抗 体。完全抗体|:指抗原刺激产生的抗体，其免

3、疫球蛋白的单体有两个 以上的结合点，因此又称多价抗体或多价抗体，这类抗体与抗原 结合后，可在特定的条件下出现可见反应。不完全抗体|:由于免疫球蛋白的单体屮的两个结合位点之一失去 免疫活性多克隆抗体抗原刺激动物机体后，有多个免疫细胞系产生的抗 体，可与同一抗原的多个决定簇结合，这类抗体叫多克隆抗体。 单克隆抗体|:由单一的细胞系生产只能识别抗原的某一决定簇的 抗体。掌握单克隆抗体和多克隆抗体的概念3虽然抗体的种类很多，但是化学本质是一样的，均为球状糖蛋口，既Y球蛋白，简称（yG），丫G的分子量15万dt100万dt之间， 由于其中的一部分yG不具备抗体的特性，我们通常将具有抗体活 性的YG称为免

4、疫球蛋白，简写（IgG）。（考核的知识点是抗体的 化学本质及分子量）4 Ig有多种类型，其基本的结构均由两条重链和两条轻链组成，经 二硫键连接呈Y型。如图所示：在木瓜蛋口酶的作用下，可水解为三个片段，既两个Fab 片段和一个Fc片段，每一个Fab片段含有一条完整的轻链和一条重 链的一部分，Fc片段有两条重链的剩余部分组成。Fab片段含有可变区，可与特定的抗原结合，Fc片段则无抗体的活性，但与补体结合反应、凝集反应、组织致敏等活性有关，并能与非特异性结合蛋白结合（考核的知识点是抗体的结构及组成）二 单克隆抗体和多克隆抗体的区别1定义的区别单克隆抗体：有一个B细胞衍变的浆细胞产生的抗体，只是针对抗

5、原的某一决定簇有特异性免疫反应。多克隆抗体：抗原在刺激动物机体后，由多个免疫细胞系产生的抗体可与同一抗原的的多个决定簇结合。2性质的区别特征单克隆抗体多克隆抗体理化特性单一多样对外界环境（如PH,冷冻，解冻）非常敏感较不敏感使用期限无限有限批间差异较小较大有用的抗体含量5mg/ml （腹水）< lmg/ml与同等纯度的免疫原无交叉反应有交叉反应酶来源I系酶II酶三单克隆抗体的制备1原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种 抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可 能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。 将这种B细胞与非分泌型的

6、骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进 一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能 力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的 杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的 特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：单一特异性，与一个 抗原决定簇反应；可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； 一经制出，可无限量地供应；生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗 原；2 HAT系次黄卩票吟(hypoxantin)、氨基蝶吟(aminopterin)和胸 腺喀唳脱氧核哥(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养 基也

7、就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核 苗酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径(de novo pathway)和 中间合成途径(salvage pa-thway) o由于氨基蝶吟可阻碍起始合成 途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须 供给核苗酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死 亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培 养进行选择，例如卩票吟的中间合成途径缺失株和喀唳的中间合成途径 缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶吟的存 在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞 进行选择

8、。次黄瞟吟和胸腺喀唳脱氧核首可作为中间合成途径的原料 而进行添加。抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传 基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的 B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许 多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂 增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形 成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细 胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。3步骤4单克隆抗体的注意事项（1）免疫的动物和骨

9、髓瘤细胞系的选择用杂交瘤技术生产单克隆抗体，需要三种用途的实验动物，第一是 提供脾脏细胞的动物，供融合使用，第二种动物是用于制备腹水瘤， 第三种动物是提供饲养细胞，三种动物必须是同一类，而且跟我们使 用的瘤细胞是同一系的，这是因为不同种系的细胞进行杂交融合的成 功率较低，而且会出现单相染色体丢失的自然排出的现象，我们统一 使用的是BALB/C小鼠，骨髓瘤细胞系为SP20。（2）融合和融合剂的选择现在最常用的是聚乙二醇（PEG）,它可以使正在进行有丝分裂的 骨髓瘤细胞和B细胞的膜发生变化，随即两个细胞结合在一起，然 后在不含融合剂的基础溶液的作用下终止融合。（3）抗体的检测由于制备单克隆抗体所用

10、的抗原的特异性不同，因此很难用同一种方 法来检测不同的单克隆抗体，目前最常用的ELISA技术。（4）杂交瘤细胞的克隆一般的原则所谓的克隆化是将单个细胞通过无性繁殖而该细胞集 团的整个培养过程。刚融合的细胞不稳定，染色体容易丢失，因此需要克隆获得能稳定分 泌抗体的细胞系，一般融合后的杂交瘤细胞要经过至少3次以上的克 隆化，使单克隆孔的检测阳性率达到100%o克隆的方法最常用的为有限稀释法和显微镜法（5）腹水的制备目前大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：动物体内的诱生法，实 验室较常用，另一种是体外培养法，通常是工业生产将培养好的细胞注入事先注有石蜡油的小鼠体内，待腹腔肿胀时， 便可收集腹水，再将抗体进行纯化处理，即可。（6）细胞的冻存杂交瘤细胞株建立应尽快冻存，长时间的克隆也可导致染色体的丢 失，冻存的原理是在保护剂的作用下储存在一196°C的液氮中，可以 保持在5到10年。（7）细胞的复苏冻存的细胞