PCR荧光检测试剂盒生产质控规程

1、PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程一.微量加样器的使用规定1 .微量加样器校正：使用微量加样器吸10仙l 10次是否为100仙1。2 .加样前吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式 吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头管腔，以保证加样的一致性。3 .加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头的液体顺着管壁流出，防止液滴的 形成由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。4 .吸头是否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。5 .加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一 停点，缓慢慢慢吸入液体。停留 1s,然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸

2、嘴外 面可能黏附的液滴。放液时经过第一停点，停 1-2s后，继续按压到第二停点， 排出残余液体。6 . PCR5应原液由于有甘油在冷的状态较黏稠，易于1次吸取数人份，慢一 些。7 .边加边看，直观估计，防止跳管。8 .低温冷藏批量DNM取液、PC阪应液A和B取出时是否充分混匀后，分 装使用，PC网应液A和B是否避光低温冷藏和使用。9 .配PCRK应液应先加缓冲液再加 PCRK应液充分混匀，必要时倒置混匀， 再离心，或用灭菌吸头上下吸几次。10 . PCR5应液（包括样品）应充分混匀：保证PC网应曲线呈S形，全阴性 样品呈近似水平曲线。PCR式验操作规程程序操作检查操作1混匀方法每一次提醒注意倒

3、置混匀、移液器吹打、震荡， 50000rpm离心1分钟。2取血清样本1）因水分蒸发变浓2）冻状、混浊按（1）法混匀，再取25 口加水5 混匀。温水浴37 c溶解按（1 ）法混匀，或12000rpm离心5分钟,取清液。3取质控品冻状、混浊温水浴37 c溶解按（1）法混匀或12000rpm 离心5分钟，取清液。4血清样本稀释混匀血清阴性血清40 加阳性血清10 小，按（1）法混匀。5倍稀释5质控品稀释混匀质控品血清稀释液40 口加质控品10 小，按（1） 法混匀5倍稀释。6血清样本DNA提取DNA取液完好血清样本按（1）法混匀，取30 口力口 DNA 提取液60。，按（1）法混匀，98 C 8分

4、钟变性，0 C冷却 2-3分钟，12000rpm, 离心10分钟，吸取上清液。7质控品DNA变性分装，有效，呈清液状态，未反复加热、冻融质控品按（1）法混匀，取 30pl5000rpm 离心1分钟,98 C 5分钟变性,5000rpm , 离心1分钟，吸取上清液。8PC取应液混匀状态取25 口反应液加5 口提取DNA按（1）法混匀，5000rpm离心1分钟，5000rpm ,离心1分钟，吸取上清液。9PC即应室温10-30 CPCR反应槽四角不放管。10设阴性对照阴性混匀血清CT3811阳性经f品各浓度呈梯度以PCR版应液制作标准曲线，呈直线。12阴性质控品B各浓度呈梯度以PCR解口 B反应液

5、制作标准曲线，呈直线。*血清稀释液：全阴性血清再加 2倍HBV DNAI取液混匀,5000rpm ,离心1分 钟，混匀血清98 C 5分钟变性，12000rpm,离心10分钟，吸取上清液。三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程1 .目的建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标准化2 .职责质量部QC负责本文件的起草，质量部及QCfe验人员负责本标准的实施。3 .范围本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。4 .内容4.1 超净工作台的主要组成部分：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气 控制及排气管道部分。4.2 安放点的选择：4.2.1 应安放于卫生

6、条件较好的地方，便于清洁，门窗能够密封以避免外界 的污染空气对室内的影响。4.2.2 安放位置应远离有震动及噪音大的地方。4.2.3 严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方,以保证操作区空气的正常流 动。4.3 使用前的检查：4.3.1 接通超净工作台的电源。4.3.2 旋开风机开关,使风机开始正常运转,这时应检查高效过滤器出风面是否有风送出。4.3.3 检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程部检修。4.3.4 工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理，认真进行清洁工 作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理。4.3.5 净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流动不受干扰

7、。4.4 使用：4.4.1 使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。4.4.2 接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工 作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。4.4.3 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。4.4.4 操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关, 用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。4.4.5 最后开启工作台紫外灯，照射消毒 30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。4.4.6 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作

8、台处于最佳状况。4.4.7 每月进行一次维护检查，并填写维护记录。4.5 清洁4.5.1 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。4.5.2 取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘。4.5.3 用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干。4.5.4 要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌能力.4.5.5 效果评价：设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。4 .检验方法操作规范1 .混匀：反应液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后5000 rpm离心数秒（按 原说明进行）。2 .准确：反应液及样本混匀后，每一步加样准确（

9、按原说明进行）。3 .新鲜血清样本： 血清样本混匀后离心（5000 rpm离心数秒），取30履， 加2倍量DNAI取液60仙l混匀100c 8-9分钟变性，放置冰箱0c冷却2-3 分钟，12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5膜加样。4 .长期放置冰箱冷藏血清样本：取 25膜，加无菌水5仙l加2倍量DNA! 取液60膜 混匀98 C 8-9 分钟变性，放置冰箱 0 c冷却2-3分钟，12000rpm 离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5仙l加样.5 . DNA提取液处理并冷藏保存血清样本：DNAI取液处理：血清样本混匀，取200 N l ,力口 DNAiS取液4

10、00 N l混匀98 C 5分钟变性，放置冰箱0c冷去2-3分钟，12000rpm离心5分钟，取出全部上清 液置另1管混匀，冷藏保存，按100膜/管分装冷藏保存.保存血清样本使用：取1管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀，5000 rpm 离心数秒，再取30-40屋98c 5-6分钟变性，放置冰箱0c冷去2-3分钟，5000 rpm离心数秒，再取51加样.6 .质粒DNA有关质寸5品（P和N）:用全阴性血清与质粒 DNA按9:1混匀， 5000rpm,离心1分钟，再加2倍HBV DNA1取液混匀，5000rpm ,离心1分钟， 混匀血清98C 5分钟变性，12000rpm,离心10分钟，吸取上清

11、液，取出全部上清 液置另1管混匀，冷藏保存，按100膜/管分装冷藏保存.有关质控品使用：取1管分装冷藏保存质控品，融化后混匀，5000 rpm离 心数秒，再取30-40履98 C 5-6分钟变性，放置冰箱0 c冷去2-3分钟，5000 rpm离心数秒，再取51加样.5 .防止荧光定量PCRT物污染的质控规程1 .目的规范荧光定量PC骸验和生产的操作过程，确保操作过程中无PCR"物污染。2 .适用范围本规范适用于荧光定量PCRS验和生产的操作过程。该规程参照中华人民共 和国艾滋病核酸检测技术规范。3 .职责划分操作人员按照此标准操彳规范进行荧光定量 PC双验和生产，质检部经理负 责监督

12、。4 .质量保证体系4.1 实验室和生产工作区质控体系4.1.1 实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备区（GMPA同超净工作室）、样品处理区（质检室1）、扩增区（质检室2）和扩增 产物分析区（质检室 3）。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区的功能 是：（1）样品处理区：样品登记、分装。各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提 取、保存和加样。（2）试剂准备区：PCFT增试剂的配制、分装和保存。（3）扩增区：普通PCRT增及荧光定量PCFT增。（4）扩增产物分析区：PCRT增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、 报告。4.1.2 用有效的方法对操作区域和共用器具在实验

13、前后进行清洁及消毒 推荐的程序是：a.实验前将次氯酸钠溶液或70%.醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后 用纸巾擦除。b.移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。c. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放 器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%.醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。4.1.3 实验工作区内必须穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根 据要求戴不同规格的手套。4.1.4 PCR产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时，如特

14、定的凝 胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCRK及分析软件，每位实验人员都要准确的命名自己的设置程序及分析结果， 使用完毕后需收拾好所用的仪器并保 存好自己的实验分析结果。4.1.5 各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。4.2荧光定量PCRT增实验过程控制体系：4.2.1 样品的采集和处理4.2.1.1 用于普通PCRE荧光定量PCR佥测的样品有细胞、全血、血浆、各 种组织和其他分泌物，有时还包括生物制品。4.2.1.2 采集样品应避免微生物和核酸污染（所用器皿必须无菌或属于一次 性用品，RN联样品所用器皿必须没有 RN服污染）。4.2.1.3 处理样品应在样品处理

15、区由专人进行。处理和保存用于抽提DNA戈 RNA勺样品应避免DNA£ RNA#造成的降解，通常要求在采样后1小时内处理并 低温保存。4.2.1.4 处理后的样品应分装、标记（需用防水的笔填写），并做好实验记 录，冻存于-20 C以下，DNA£ RN陵样品应冻存于-60 C或保存在液氮中。4.2.2 核酸（RNA/DNA 提取4.2.2.1 应在规定的区域内由专人按相应程序进行。4.2.2.2 应保证无细菌及核酸污染,实验材料和容器应经过消毒处理并一 次性使用。4.2.2.3 提取RNA寸应避免RNAB污染，抽提RNA羊品实验使用的移液器 及离心管等用品必须用 DEPCt理，

16、去除RNARo4.2.2.4 配制RNA©转录或DNAS应试剂，所有操作超过10分钟时应将 反应管置于冰盒内，防止各种酶及样品DNA|£ RNAI解。4.2.3.3 进行逆转录反应时应避免 RNAB污染，实验使用的移液器及离心 管等用品必须用DEPCt理，去除RNAWo4.2.3.4 扩增仪应预热，时间不少于 20分钟。4.2.3.5 进行内参基因的扩增（Bactin或GAPDH并设置递增PCR1环 数，电泳确定逆转录的效率及 CDNA羊品的起始浓度，为荧光定量 PC双验做准 备，成功的逆转录样品在PCFT增时25个循环即可见清晰的内参条带。4.2.4荧光定量PC双验：4.

17、2.4.1 应在样品处理区内加样。快速准确的将样品DNAlE RNA、心加入装 有反应液体的反应管内，盖紧盖子并做好标记。4.2.4.2 操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内，防止酶降解及副反应 发生。4.2.4.3 严格按照荧光定量PC敬的操作手册启动机器，设置实验扩增程序， 保存文件，最好以日期及样品名称命。PCFT增仪应预热，时间不少于20分钟。4.2.4.5 将反应管置于扩增仪上，开始扩增。4.2.4.6 反应结束时停止实验程序，取出反应产物，20c保存。4.2.4.7 扩增结果分析和定量按照操作手册进行，对三孔平行的实验结果必 须首先判断其是否准确（孔间差异0.3时应考虑舍弃该孔数

18、据，并重新进行该 样品的荧光定量PC蚊验）,然后根据标准曲线计算出各样品的浓度。4.2.7.8结果报告中应注明使用的实验方法、实验试剂、实验仪器及样品种 类和样品量。4.3客户沟通质量体系：4.3.1 收到样品后，由专业的负责人进行样品的清点和整理工作，以确保 样品数目的准确性和样品的有效性。如有问题，应及时的与客户进行沟通。4.3.2 在确保样品无误和有效的情况下，由专业的技术人员进行样品的处理工作核酸的抽提工作（按照标准操作）；并进行抽提的DNAE RNA勺浓度测定。在此步骤实验结束后，将结果整理，并及时的发送给客户。如有问题出现， 则和客户及时沟通，保证实验的下一步工作。4.3.3 在确

19、保核酸的抽提正确和有效的前提下，进行逆转录的实验过程（按 照标准操作进行）。实验结束后，将结果整理，并及时的发送给客户。如有问题 出现，则和客户及时沟通，保证实验的下一步工作。4.3.4 在确保逆转录正确和有效的前提下，进行样品的预实验过程。摸索检 测基因的反应条件，并将结果及时通知客户。4.3.5 在预实验成功的前提下，进行正式的荧光定量PC双验。实验开始后， 每周和客户进行一次沟通（可以通过电话或e-mail及网络方式），汇报实验的进 展情况，并认真记录客户提出的建议和意见，对出现的问题随时协商解决。六.试剂盒的生产和制备1试剂盒的生产和制备地点在GMPt化车间进行，净化车间内工作的人员应

20、穿着符合要求的工作服和帽子。 选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气 洁净度级别要求相适应，并不得混用。2工艺用水 制水设备应满足水质要求并通过验证，经灭菌处理。3微量加样器 使用前后用灭菌消毒的纸包好，置传递窗，紫外线消除DNA30 分钟。4生产区域定期清洁、清洗和消毒生产区域定期清洁、清洗和消毒，高风险的生物活性物料其操作应使用单独的空气净化系统，与相邻区域保持负压， 排出的空气不能循环使用。5质粒DNAtU备和提纯 在质粒DNASJ备和提Z程中，所有器具都应灭菌消 毒，紫外线照射，确保无质粒DNAF口 PCR物污染。质粒DNMU备和提纯后，立 即分装，置放于用高压处理的容器中，60c保存

21、，防止质粒DNAT散和被PCR 产物汽溶胶污染。6病毒(HBV)核酸定量标准品、阴性参考品、阳性参考品，质粒DNA和PCR产物污染防止将标准品和参考品包装表面清除质粒 DNAF口 PCFT物污染后，在 超净工作条件下，分装，置放于用高压灭菌处理的容器中，-60C保存，防止质 粒DNAT散和被PCFT物汽溶胶污染。7 PCR反应管的中PCR反应产物污染消除 应用尿喀噬-N-糖基化酶(UNG 酶)对DNA中dUTP的酶解彳用酶PC阪应产物DNA将UNG1 100 u单位浓度稀 液稀释到0.5u/口，每支PC网应管中加入0.2仙|进行UNGB解，消除污染。含 dUTP的 10mM dNTPE制:原材

22、料：dATP100mM250 口；dGTP100mM250 口；dCTP100mM250 小； dTATP 100mM /250 l;dUTP 100mM /250 l。配制 10mM dNTP:dATP 100mM /20l; dGTP 100mM /20 l;dCTP 100mM /20 l; dTTP 100mM /10 l;dUTP 100mM /10 l;合25 mM /80 膜，稀松.5 倍-10 mM /200 a l。PCR1环条件按以下设置：37 C 5分钟UNG#解反应，93 C 3分钟预变性， 然后93 C 30秒-55 C 30秒循环10次，93C 30秒-55 C 6

23、0秒循环30次。 37 C 5分钟UNG#解反应，使PCRS应产物污染完全消除。七.质量监控点:工序质量控制点质量控制项目频次生产前原辅料由指定供应商提供批批检验符合质量标准每一进厂批次内包装材料外包装材料纯化水符合质量标准1次/周校准原辅料符合配制要求配制物料品种、数量1次/批投料计量设备经过校验，在有效期内双人复核称量克隆菌 种保存 与纯化纯化菌种菌种复壮、纯化、防污染1次/2月阳性标 准品制 备质粒制备纯度、浓度1次/批阳性标准品制备配制、分装、低温保存阴性质 控品制 备血清蛋白制备无HBV配制、分装、低温保存1次/批PCR反应液制 备防污染、移液 器精确加量、配制、分装、低温保存随时/

24、班包材数量、无破损、色泽统一包装批号正确、清晰随时/班成品数量准确、包装码放符合要求试齐1盒 保存低温防止反复冻融，出现菌斑随时/班洁净八.生物安全准则本标准旨在规范临床实验室的安全管理，内容着重在实验室和工作人员安 全的一般要求，防火、用电、化学危险物品、微生物的安全要求，以保证实验室 的安全运作，将事故控制在最低限度。为各级临床实验室的安全管理提供依据。 1.工作人员和实验室安全的一般要求1.1 实验室工作区内绝对禁止吸烟。1.2 实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手口”接触可能的其它物 质。实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。1.3 实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆。1.4 处理腐蚀性

25、或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其它保护眼睛和面部 的防护用品。工作人员在实验室的危险区内不要佩戴隐形眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的情况时，必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。1.5 实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在 进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应立即洗手。1.6 外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上， 也不要挂在门的玻 璃隔板上，妨碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。1.7 实

26、验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、 或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。防火门前不能堆物，以确保失火时能 够自动关闭。2 .实验室用电安全准则2.1 作为仪器维护措施的一部分，应进行年度的安全用电检查并建立档案 记录。实验室应装有足够的插座，分布要合理，以减少在插座上接上其它多用插 座和避免拖拉过多的电线。2.2 所有电器设备的维修与维护只能由取得正式资格的维修人员进行。3 .实验室微生物安全准则在临床实验室，工作人员在接触标本和操作过程中，可能被感染。临床实验 室可能接触的微生物可分为三类： 病毒、细菌、其他具有高毒力的病原体，如出 血热病毒和立克次体。因为从病史和体检不能可