RNAi技术专辑之五7

1、RNAi技术专辑之五在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的 RNAi现象，实验表明通过目的基因序列的 双链RNAM以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的 dsRNA最简单的方法就是 体外转录合成双向的RNA如果研究对象不是哺乳动物细胞，那要开展RNAi的实验就要简单很多。因为可以采用较长的双链 RNAW导RNAi现象，而无需制备 特定的siRNA。在这里生物通将介绍几个制备长链 dsRNA勺试剂盒。（值得注意的是在哺乳动物细胞内，大于29nt的双链RNA引发的是非特异基因沉默，21nt 大小的双链RNA,也就是我们前面所说的siRNA能有效引发特异的基因沉默。由于体外转录很难合成25nt以

2、下的短链RNA ,生物通在前面为大家介绍了一些利用试剂盒或者质粒合成siRNA的产品。参考相关文章）MEGAscript? RNAi Kit合成大量纯净的双链RNAI RNAi实验成功的关键。这个基于专利的转录 高产技术的产品正是为大量合成用于 RNAi实验的dsRNAffi优化的。试剂盒要求 用两端带有T7启动子序列的目的基因作为模板（200nt以上，模板可以是质粒 载体上的，也可以是用带有T7序列的引物扩增的PCFT物，另外也可以选用一 个叫Lig' n Scribe Kit可以将T7 Prometor序列直接连接到 DNAt断的两端）, 将模板和试剂盒提供的dNTP酶等混合，根据

3、模板的长短进行体外转录反应。 每次反应可以合成50ug100ug甚至更多的dsRNA（800nt以上的需要先加热变性 并褪火形成双链），产量是常规的1050倍，整个试剂盒总产量可达2mg （20 次反应，每次100ug）。合成的产物经过DNaseI消化去除DNA®板，再经过特 殊的单链RNase （试剂盒里提供，后文介绍）除去单链的 RNA最后经过柱纯化 就得到纯的双链RNA即可用于RNAi实验。由于这个试剂盒提供全套产品，使 用相当方便。50Silencing of Drosophila hrp48 and U2AF Protein by dsRNA.A. Specific Red

4、uction of ExpressionLevels. 1 x 10 6 Schneider' s Drosophila analysis was also performed with the anti-U2AF 50 (bottom panel) and Pab 1 (data not shown) antibodies as negative controls.rM dsRNA 仃 3 labeledUlAP5aPab ID I 5 师 出trptt根的必.Nhrp4&UlAFSflmelanogaster L2 cells were grown in 6-well pl

5、ates in serum-free medium and treated with 10 nM of dsRNA specific for either hrp48 or U2AF 50 dsRNA were prepared with the MEGAscript RNAi Kit and post-transcriptionally labeled with Cy3using the Silencer siRNA Labeling Kit when indicated (+). Cells were harvested 72 hours post treatment and the si

6、lencingeffect was analyzed by Western blot with anti-hrp48 (48 kDa, migrates as a doublet) and anti-U2AF 50 (50 kDa) antibodies. An antibody directed against Pab 1 (lower panel) was used as a second negative control. B. Dose-sensitive Reduction of Protein Expression Levels.dsRNA-triggered silencing

7、of hrp48 was analyzed as in Figure 2a using the indicated concentrations of hrp48 dsRNA made with the MEGAscript RNAi Kit. WesternHiScribe? RNAi Transcription KitRNA干涉(RNAinterference) 是近年产生的研究转录后剪切的一种实验 方法。它将目的基因所对应的双链 RNA导入生物体，导致相应的 mRN降解。和 反义技术不同的是，在基因表达恢复之前，RNAF涉现象将持续多个细胞分裂周 期，因而它是一种有力的研究基因功能的工具

8、。它不是传统的在DNAK平基因敲除，而是通过RNAF涉，在RNAK平上去除目的RNA这样大量基因功能可以 快速经济地进行检测。HiScribe? RNAi Transcription Kit 也是一个体外合成双链 RNA4彳亍 RNA 干涉实验的试剂盒。不同于前者的是，这个试剂盒提供质粒作为载体，方便了以 后的扩增和复制。LITMUS?载体多克隆位点两端带T7启动子。目的序列插入多 克隆位点，利用T7 RNA聚合酶同时转录DNA1板的双链，合成双链 RNA载体 启动子为T7野生型序列，是已知最强的启动子之一，以保证转录产率的最大化。 带有插入lacZ a片段供蓝白筛选。该试剂盒也可合成单链RN

9、A在RN阁构研究，核酶化学，体外翻译， RNAS白相互作用，反义技术等方面有广泛应用。该试剂盒包含LITMUS双向转录克隆载体，适用体外如显微注射、细胞转染和体内RNAF涉在内的所有转录实 验。该试剂盒包括足够的试剂可在 2ml的反应体系中合成多至2mg的双链 RNA 包括：LITMUS 28i 克隆载体，LITMUS 38i 克隆载体(LITMUS 28i 和 38i 二者只是多克隆位点有所不同)，对照载体，T7引物(19-mer),5' -dTAATACGACTCACTAT/3GG-10X 含 NTP的缓冲液，T7 RNA聚合酶，上样缓 冲液和电泳 Marker 2-Log DNA

10、 Ladder (100 - 10,000 bp)等等。价格也相当， 3750人民币。但是可惜的是试剂盒没有提供消化DNAf版和单链RNA勺酶以及纯化的工具，需要另外购置。单独购买的相关产品生物通将在后文继续介绍。更多关于RNAi产品介绍请继续关注生物通技术前沿专栏。Figure 1:用带插入子的 LITMUS 28i合成双链RNAFigure 2: 用 HiScribe RNAi Transcription Kit 体外合成单链和双链 RNA。LITMUS 38i含1.3 kb荧光酶片段，分别用 PspOM I (P)和Stu I (S)剪切。产生的线形摸板再分别(P和S )或一起转录(P/

11、S),产生单链和双链RNA。琼脂 糖电泳1 U反应液至少含0.5因RNA。在细胞内表达siRNA引发基因沉默RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能，常见的做法是将靶向特定基因的大约 21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs),或者是 45 50-mer 的发夹结构 RNA(small hairpin RNA, shRNA转染到细胞。shRNAft细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉 默或者表达抑制。现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。尽管细节各有不同，但载体大都是用PolIII启动子启

12、动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用PolIII启动子的原因在于这个启动子 总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA遇到45个连续的U即终止，非常精确。当这种带有 PolIII启动子和shRNA®码序列的质粒转染哺 乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的 选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就 是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。因为质粒的价钱大约是 30

13、00多人民币，还不到化学合成1条21nt的 RNA介格的一半，但是就可以自行制备 siRNA而不受数量的限制。生物通在这里 为大家介绍几种不同的siRNA合成质粒，但是大家要注意的是这里介绍的siRNA 质粒是不同于体外转录合成 RNA勺质粒(生物通在后文会继续为大家介绍)，因 为这里制备的是用于哺乳动物细胞实验的siRNA,而不是长链的RNA(长链的dsRNA适宜用在哺乳动物细胞，因为会引发非特异抑制，参考RNAi一回顾)pSilencer siRNA表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达 siRNA的一系列载体。在载体上包含有 RNAK和酶III (PolIII )启动子，氨 苇抗性

14、基因和大肠杆菌复制子，只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其RNAfg形成发夹结构(就是回文结构)的 DNAff列插入载体中Pol III启动子的 下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的RNA这种RNA1快在细胞中加工成为siRNA。这些表达载体已经成功的在Hela细胞中抑制了包括Cyclophilin 、 GAPDHp53、c-myc在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体外合成的siRNAs抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的siRNAs抑制。pSilence 1.0-U6载体pSilence 1.0-U6是采用小鼠U6 Pol III启动子。这个由哈佛大

15、 学开发的载体已经成功的在 Hela、H1299, U-2 OS和C-33A细胞中敲除了 cdk-2 和laminA/C的表达。这个载体经过 Apa I和EcoRI酶切线性化和纯化，你只需 要合成一对55-mer的寡核甘酸，带有4个碱基的突出（当然是对应ApaI和EcoR I酶切位点咯），一起退火、快速连接就可以转化了。在购买线性化的质粒同时， 厂家还提供带有GAPDHiRNA的环形质粒对照（万一线性质粒不够用还可以自己 扩增再切嘛！）pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1这两个载体带有不同的RNAPol III启动子，pSilencer 2.0-U6带的是

16、 人的U6启动子，pSilencer 3.0-H1则是用H1 RNAO动子（RNaseP的一个组成 部分）。这两个载体都是用BamH和Hind III线性化并且经过纯化的，方便定向克隆。这两个载体都是以线性化的质粒供应，同时还提供GAPD时照和一个空白对照质粒，以及DNA!火的Buffer。？pSilencer siRNA Expression Vectors; Maps and siRNA DesignFor each target gene two complementary 55-60 mer oligonucleotides must be prepared. The oligonuc

17、leotides should encode the 19 mer hairpin sequences specific to the mRNAtarget, a loop sequence separating the two complementary domains, and a polythymidine tract to terminate transcription by RNA Pol III. The insert design shown above is specific for the pSilencer 2.0-U6 and 3.0- H1 Expression Vec

18、tors and contains the overhanging 5' ends to facilitate efficient and directional cloning into these plasmids. The insert for pSilencer 1.0-U6 would contain the appropriate end sequences for cloning into theApaI and EcoR I sites. Early indications suggest that a great deal of latitude is availab

19、le in the design of the loop; here we provide our default loop sequence that we find works well.Freer 1.Q U6 GAPDHsf eCtAdpSEmrcr 1.a-U6 fiAPCMA.120-GAPDI-I Reductionion1。口SO -60 -40 -15pSknccr LD-Ufr GArOHSAMPLhCELL *SIGNALCELL &JGNALREUVHVE EXPfiE$SlOMNo隔芦4呻则307US3sHMJ«03S100p£rferbce<'I.QW GAFg24222M66+&O91815c.pSilencer -Induced Reductions in Target Gene ExpressionpSilencer 2.0-U6 and 3.0-H1 vectors encoding hairpin siRNAs specific to GAPDH, cyclophilin, or a non-genomic sequence were transfected into HeLa cells. Forty-eight