木瓜蛋白酶酶活力检测方法

1、木瓜蛋白酶酶活力检测方法南宁庞博生物工程有限公司企业标准Q/NPB 01-2019食品添加剂 木瓜蛋白酶制剂1 、 范围本标准规定了食品添加剂 木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检 验规则、标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、 调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂 木瓜蛋白酶制剂。2 、 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其 随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本 标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期

2、的引用文件，其 最新版本适用于本标准。GB/T 191-2019 包装储运图示标志GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂 杂质测定 用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准GB/T 4789.2-2019食品卫生微生物检验 菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验 大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验 沙门氏菌检测 GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验 致泻大肠埃希氏菌检测 GB/

3、T 4789.10-2019 食 品卫生微生物检验 金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定GB/T 5009.74-2019食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生 标准GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄 糖JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY

4、/T 691-2019 番木瓜定量包装商品计量监督管理办法 国家质量监督检验检疫总局令（ 2019）第 75 号 3 、 原辅料要求 3.1 水应符合 GB 5749-2019 规定 3.2 木瓜果应符合 NY/T 691-2019 的规定 3.3 葡萄糖应符合 GB/T 20880-2019 中无水葡萄糖的规定 3.4 食品添加剂食品添加剂使用的品种和使用量应符合 GB2760 的规定，质量应符合相应产品标准的 规定。 4 、 技术要求 4.1 感官应符合表 1 的规定表14.2 理化指标 应符合表 2 的规定。4.3 微生物指标 应符合表 3 规定。5 、 试验方法 5.1 一般规定本标准

5、所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682-2019 中规定的三级水；所述溶液如未指明溶剂，均系水溶液；所有滴定分析用标准溶液按 GB/T 601-2002 配制和标定；所有杂质测定用标准溶液按 GB/T 601-2002 配制；所有试验方法中 所用制剂和制品按 GB/T 603-2002 配制。 5.2 感官用目测、鼻嗅、口尝方法检查。 5.3 理化指标 5.3.1 酶活力的测定 5.3.1.1 原理 蛋白酶在一定温度与 PH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应， 并使未水解的酪蛋白沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸 收度

6、计算酶活力。 5.3.1.2 酶活力定义在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成lug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）o 5.3.1.3仪器和设备恒温水浴（37±0.2 °C）.紫外分光光度计。 5.3.1.4 试剂和溶液 5.3.1.4.1 酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3N7NO2SHCI H2O=157.635.27g，氯化钠（NaCI）23.4g，加水500mL溶解，另取乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O （该物质在水 中的溶解度不高，如果没有溶解会使溶液出现浑浊现象）2.23g，加水200mL溶解，合并两液均匀，用O.1mol/L氢氧化

7、钠溶液或O.1mol/L盐酸溶液调至PH=5.5 （初次配该溶液PH原始值为1.75，需要加0.5mol/L的氢氧化钠25ml左右调节至PH=5.5），加水稀释至1000mL。 5.3.1.4.2 0.05mol/L磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HP04 12H2O 17.89g，加水溶解，并定容至 1000mL （该溶液 使用量为80ml，配制时可考虑配 100ml） 53143酪蛋白溶液（该溶液配制过程较快，可以不用提前很久配制。）称取经硅胶干燥器中干燥至恒重的酪蛋白（干酪素，不经干燥至恒重仍可做检测）0.6g （精确至0.0002g ），置烧杯中，加入 0.05mol/L磷酸氢二钠

8、溶液 80mL在沸水浴中 边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸调至PH=7.0 （初次配该溶液，配制好后PH值在7.5左右，需要加盐酸调节，0.1mol/L的盐酸用量为5ml左右），转移 到100mL容量瓶中，加水至刻度。临用现配。53144三氯乙酸溶液称取三氯乙酸（C2HCI3O2 17.99g，加无水乙酸钠（CH3COONa29.94g和冰乙酸（CH3COQH18.9mL，加适量水溶解后，加水定容至1000mL,振摇均匀。5.3.1.4.5 酪氨酸标准溶液称取于105C干燥至恒重的酪氨酸 50mg（精确至0.0002g ），用0.1mol/L盐酸溶解， 移入100mL

9、容量瓶中，并用0.1mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。吸收1.00mL置10mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸至刻度，摇匀，即得含酪氨酸50ug/mL的溶液。5.3.1.4.6 试样溶液（稀释倍数为 25000）称取适量试样（精确至 0.0002g ）（稀释倍数参考表 4）置研体中，加少量酶稀释液 研磨20min,用酶稀释液移至250mL容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；根据不同 品种酶活力高低，吸取适量试样溶液置于容量瓶中，加酶稀释液稀释至适当浓度（稀释至 试样溶液吸光度在0.20.6范围内），充分摇匀，供测试用（60min内使用）。表45.3.1.5 测定步骤吸取试样溶液1.00mL置

10、于10mL具塞比色管中，于 37C± 0.2 C水浴中保温10min,加入在37C± 0.2 C水浴中预热的酪蛋白溶液5.00mL，摇匀，置37C± 0.2 C水浴中，反应 10min,加入在37C± 0.2 C水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00mL,摇匀，于37C± 0.2 C水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤，取续滤液，在2h内，在波长为275nm处用蒸馏水作参比测出滤液的吸光度A1°（可做两个平行，第一次测定两个平行值分别为 0.389、0.399）空白试验：吸取试样溶液 1.00mL置于10mL具塞比色管中，于37C±

11、; 0.2 C水浴中保 温10mi n,加入在37C± 0.2 C水浴中预热的三氯乙酸溶液 5.00mL,摇匀，反应10min , 加入在37C± 0.2 C水浴中预热的酪蛋白溶液 5.00mL，摇匀，于37C± 0.2 C水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤，取续滤液，在2h内，在波长为275nm处用蒸馏水作参比测出滤液的吸光度A2。（初次测定该值为 0.292）酪氨酸标准溶液吸光度：用蒸馏水作参比，在波长275nm处测定50ug/mL酪氨酸标准溶液的吸光度A3o（初次测定该值为 0.346）531.6结果计算试样中酶活力X1 （ U/g）按式（1）计算：X1=

12、式中：A1 试样溶液的吸光度 A2 空白试样的吸光度 A3 酪氨酸标准溶液的吸光度m1 对照品溶液每毫升中含酪氨酸的量,单位为微克（ug）, （ 1 ）即为 50m2 试样的质量，单位为克（g） n 试样溶液的稀释倍数，即为25000 5.3.1.7允许差二次平行测定结果的相对误差应不大于10%取其算术平均值为测定结果。5.3.2 水分的测定以相同的原材料，同一班次生产的产品为一批。6.2 抽样按 GB/T 5009.3-2019的规定执行。5.3.3重金属按 GB/T 5009.74-2019的规定执行。5.3.4铅按 GB/T 5009.75-2019的规定执行。5.3.5总砷按 GB/T

13、 5009.76-2019的规定执行。5.4微生物指标 5.4.1 菌落总数按 GB/T 4789.2-2019的规定执行。5.4.2大肠菌群按 GB/T 4789.3-2019的规定执行。5.4.3沙门氏菌按 GB/T 4789.4-2019的规定执行。5.4.4金黄色葡萄球菌按 GB/T 4789.10-2019的规定执行。5.4.5致泻大肠埃希氏菌按 GB/T 4789.6-2019的规定执行。5.5 净含量按JJF 1070的规定执行。6、6.1组批6.2.1 感官、理化及微生物指标随机从每批 5%以上的包装箱中抽取样品，每箱中抽取样品约10g 左右，试样总量应不小于50g。迅速混匀后

14、分别装入两个清洁干燥的磨口玻璃瓶中，并在标签上注明生产厂名， 产品名称，批号，数量及取样日期。一瓶作检验用，一瓶留存备查。微生物检验按无菌操 作取样。 6.2.2 净含量按 JJF 1070 及国家质量监督检验检疫总局令（ 2019）第 75 号的规定进行。 6.3 出 厂检验6.3.1 每批产品均应进行出厂检验。6.3.2 出厂检验项目为： 4.1 ， 4.2 中酶活力、水分， 4.3 中菌落总数、大肠菌群，净 含量。 6.4 型式检验检验规则6.4.1 型式检验每半年进行一次，有下列情况之一时亦应进行型式检验：产品试制、正式投产时更换设备或长期停产再恢复生产时出厂检验结果与上次型式检验结果

15、有较大差异时 原料、工艺较大变化，可 能影响产品质量时 卫生或质量监督机构提出要求时 6.4.2 型式检验项目为第 4 章全 部要求。 6.5 判定规则6.5.1 质量指标合格的判断，采用 GB/T 8170-2019 中的“修约值比较法”。6.5.2 微生物指标及净含量有一项不符合本标准规定，即判定产品为不合格，不复检。 其他指标若有一项以上（含一项）不符合本标准规定，应重新从该批产品中抽取两倍样品 进行复检。复检结果全部符合本标准要求时，产品判为合格。如果复检结果仍有一项不符 合本标准规定，则判定为产品不合格。 7 标志、包装、运输、贮存 7.1 标志小时包装的标签应符合 GB 7718的规定。外包装储运图示标志应符合 GB/T 191-2019 的规定。 7.2 包装产品用塑料袋和铝箔袋包装，每袋净含量为 1000g。