75%百菌清对山茶枯斑病菌抑菌机制的初步研究

1、75%百菌清对山茶枯斑病菌抑菌机制的初步研究李小霞肖仲久姜仕敏【摘要】为了初步探明药剂百菌清对山茶枯斑病菌的抑菌机制，本论文进行了百菌清对病原菌相关酶活性的测定，实验结果显示：百菌清对山茶枯斑病菌体可溶性蛋白，复原糖，几丁质酶，几丁糖含量的活性均有一定程度的影响。【关键词】山茶；枯斑病病菌；酶活性山茶花CamelliajaponicaL.是山茶花科的常绿灌木，又名曼阳罗树、红茶花等，是常见的欣赏植物和药用植物，具有凉血，止血，散瘀，消肿等成效【1】。本课题组前期鉴定了山茶枯斑病由交链格孢菌Alternariaalternata侵染引起。2021年调查发现，该病害在贵州遵义发生严重，发病高的盆景

2、园发病率高达33%，常引起植株大落叶，严重影响植株的欣赏价值和药用价值。本试验前期通过室内毒力测定发现，供试几种药剂中，75%百菌清对山茶枯斑病病菌的抑菌效果最正确，因此，为明确该药剂抑菌机制，对75%百菌清处理后的病菌菌丝相关酶活性进行了测定，以求为抑菌机制的研究提供依据。1材料与方法1.1菌种来源山茶枯斑病样本分别采自遵义桐梓县松坎镇、正安县土坪镇及遵义市区凤凰山、三阁公园，样本经别离、纯化后置于4保存备用。1.2供试药剂75%百菌清WP，购自广东中讯农科股份。供试药剂其它主要包括：Tris-HCl0.05mol/L，pH=7.5，考马斯亮蓝G-250溶液，3，5-二硝基水杨酸DNS溶液；

3、对二甲氨基苯甲醛试剂DMAB试剂，0.8mol/L四硼酸钾缓冲液pH=9.1；1%胶状几丁质悬浮液Rodriguex-Kabana等。1.3试验方法1.3.1菌丝粗体液制备供试菌株在PDA平板培养48小时25，用直径为5mm打孔器取菌蝶接入50mlPD培养液中，摇床中培养5天120r/min，25，然后用75%百菌清药剂终浓度为25ug/ml进行处理，以不加药剂为对照，每个组重复处理3次。并分别在处理后1h、3h、6h、12h和24h收集菌丝，蒸馏水冲洗干净后滤纸吸干，-20保存备用。然后参照肖仲久等【2】的方法，进行菌丝粗提液制备。1.3.2可溶性蛋白质含量的测定参照肖仲久等【2】的方法，采

4、用考马斯亮蓝G-250溶液测定蛋白质含量，波长595nm处测定OD值，并绘图。1.3.3复原性糖含量的测定采用3，5二硝基水杨酸DNS比色法进行复原性糖的含量，于波长540nm波长处测定OD值，并绘图。1.3.4几丁糖含量的测定取1.3.1制备的菌丝粗提液0.2ml，参加0.1ml硼酸钾0.8mol/L，沸水中煮沸3min，冷却后参加3ml1%的DMAB，36保温20min，冷却，于波长544nm处测定其OD值，并绘图。1.3.5几丁质酶活性的测定1%胶状几丁质悬浮液参照Rodriguex-Kabana的方法【3】，几丁质酶活性的测定参照顾向阳【4】等的方法，以OD值波长544nm为纵坐标，药

5、剂处理时间为横坐标，绘图。2结果2.1可溶性蛋白质含量的测定实验结果显示图3，75%百菌清处理山茶枯斑病病菌后，菌体内可溶性蛋白含量在处理后1-6h呈现逐渐升高的趋势，药剂处理6h后菌体内可溶性蛋白含量最高，比对照组高了26%，在处理6h后酶活性逐渐降低，并在处理24h后菌体内可溶性蛋白含量与对照组的变化趋势相接近。2.2复原性糖含量的测定实验结果显示图4，菌体内复原糖含量在处理后直到3h前是先升高的，3h后才开始呈现出逐渐下降的趋势，75%百菌清处理菌丝3h后复原糖含量与对照组比，差距最大，比对照组高了24.1%。在药剂处理12h后，复原糖含量的变化趋势与对照组水平相当，24h后比对照低14

6、.4%。2.3几丁糖含量的测定百菌清处理山茶枯斑病病菌后，24h内菌体内几丁糖含量的变化趋势与对照组相类似，但总体看处理组含量高于对照，处理24h后幾丁糖含量与对照组差距最大，较对照组高63%。2.4几丁质酶活性的测定百菌清处理山茶枯斑病病原菌体后，在24h内表现出起伏不定的趋势，但总体来看，处理组较对照组高，处理24h后几丁质酶活性与对照组根本趋于同一水平，处理3h后处理组较对照组高39.2%。说明药剂百菌清能提高几丁质酶活性，从而使菌丝无法正常生长。3讨论与结论研究说明，百菌清防治山茶枯斑病具有非常好的效果，为进一步完善其作用机制，明确其抑菌机理。故用可溶性蛋白，复原糖，几丁糖变化，几丁质

7、酶来测其活性。可溶性蛋白测定结果说明：75%百菌清处理山茶枯斑病菌后的变化趋势说明，百菌清在短时间内诱导了菌体产生了相当量的抗药性基因的表达，随着时间的延长，该类蛋白的产生受到了抑制，也即是药物对该菌的抑制作用方式之一。复原糖测定结果说明：百菌清处理组的山茶枯斑病菌体内复原糖含量比对照组高，但效果不是很明显，药剂处理12h后，复原糖含量的变化趋势与对照组相似，24h后处理组比对照低14.4%。说明百菌清处理菌丝一段时间后12h，可阻碍山茶枯斑病菌丝从环境中吸收复原糖，从而抑制山茶枯斑病菌丝正常生长。几丁糖测定结果说明：百菌清处理山茶枯斑病病原菌3h，几丁糖含量与对照组相比达最大值，24h后几丁

8、糖含量与对照组差距越来越大，说明在一定时间内，百菌清对山茶枯斑病菌的生长有抑制作用，随着时间延长，抑制作用会逐渐减弱。几丁质酶测定结果说明：百菌清处理1h后，菌体内几丁质酶活性显著升高，到3h达最大值，而后逐渐降低，但仍高于对照，这说明，百菌清可能诱导山茶枯斑病病菌细胞壁水解酶基因的表达，进而细胞结构的完整性受到破坏，使病原菌生长受到抑制甚至死亡5-7。【参考文献】【1】张艳芳，屈爱桃.山茶花的研究进展J.中国名族医药杂志，2021，1010：41-44.【2】肖仲久，李小霞，邹钦.氟硅唑对白术白绢病菌抑制机制的初步探究J.农药，2021，526：439-441.【3】Rodriguex-Ka

9、banaRetal.Thedeterminationofsoilchitinaseactibity：ConditionsforassayandecologicalstudiesJ.PlantandSoil，1983，75：95-103.【4】顾向阳，胡正嘉.一种测定土壤几丁质酶活性的方法J.土壤通报，1994，256：284-285.【5】管原洁，日副岛正美.蛋白质的定量法M.2版.张旭，译.北京：农药出版社，1981：186-188.【6】RICHARDP，TOMM，ISABELLEG，etal.SensitivitydistributionofSeptoriatriticiisolatestoflusilazoleforconsecutiveyears1993，1994and