分子克隆——主要步骤_第1页
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文档简介

1、笔记3 （分子克隆2要步骤）创作：欧阳总时间:2021.02. 13分子克隆可以分为以下几个步骤（1）带有目的基因的DNA片段的获得（2） 重组DNA分子的构建（3） 重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选（4） 特定重组克隆的鉴别分离制备待克隆的DNA片段将靶DNA片段与载体在体外进行连接重组DNA分子转入宿主细胞筛选、鉴定阳性重组子重组子的扩增。7?带有目的基因的DNA片段的获得：可以用扛£上£dna,再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用组成的DNA片段，可以应mRNA做模板，用反律介成互补DNA,即cDNA,也可以应化学合 成的方法玄接合成一段DNA o2

2、?重组DNA分子的构建：重组DNA分子中包括两部分， 一部分是外源DNA,即 目 的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质 粒、 噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种 DNA,则它们的末端完全相 同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA分子。在没有互补单链末端的情况下， 也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。3?重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达.这个过程叫做 转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的 宿主细 胞。除此以外.其他细菌、酵母、哺

3、乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞（在平板上表现为单个菌落，亦称克隆）中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。4 ?特定重组克隆的鉴别: 由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中,们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法匚要仃 核酸杂交法和免疫化学法。1I，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源 DNA片段上的基因的结构和功育匕主要有酶切图谱的制定，基因在DNA片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体

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