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1、亚甲蓝上调Nrf2/ARE 基因表达以及阻断tau蛋白引发的神经毒性 赵萍 译 注意： 为了给同学节省时间，请各位好好珍惜这篇文章，因为是我逐字逐句翻译出来的。 （*小字是其他文献或百度知道或维基百科或google中查询的知识点，一般是对前一个生物 名词的解释； *大字加粗是此文的翻译内容。 *下划线的大字加粗是自我觉得没翻译明白的； *蓝色的是翻译明白但这句话我不理解的，请老师帮解释 *一些图片，非本文内容，为了方便大家理解，方便大家直观的明白实验的操作，我从文献 或者一些网站中截图截下来的） 小知识点：（亚甲蓝：1 亚甲蓝是氧化剂，也是解毒药物。用于治疗高铁血红蛋白血症等。 对急性氰化物中

2、毒、能暂时延迟其毒性 2 亚甲蓝本身系氧化剂，根据其在体内的不同浓度，对血红蛋白有两 种不同的作用。低浓度时6-磷酸-葡萄糖脱氢过程中的氢离子经还原 型三磷酸吡啶核苷传递给亚甲蓝，使其转变为还原型的白色亚甲蓝； 白色亚甲蓝又将氢离子传递给带三价铁的高铁血红蛋白，使其还原 为带二价铁的正常血红蛋白，而白色亚甲蓝又被氧化为亚甲蓝。亚 甲蓝的还原-氧化过程可反复进行。高浓度时，亚甲蓝不能被完全还 原为白色亚甲蓝，因而起氧化作用，将正常血红蛋白氧化为高铁血 红蛋白。由于高铁血红蛋白易与CN-结合形成氰化高铁血红蛋白， 但数分钟后二者又离解，故仅能暂时抑制CN-对组织中毒的毒性。 3 化学名：氯化-3.

3、7-双(二甲胺基)吩噻嗪-5-鎓三水化合物） （ tau蛋白: 微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。Tau蛋白是含量最 高的微管，相关蛋白。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合 促进其聚合形成微管：与形成的微管结合，维持微管稳定性降低，微管 蛋白分子的解离，并诱导微管成束。而阿尔茨海默症（老年痴呆症）患者 脑的Tau蛋白则异常过度磷酸化，存在大量异常Tau蛋白，并丧失正常生 物功能。 摘要:亚甲蓝是一种吩噻嗪，它能够穿过血脑屏障（其他文献中解释血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞（MVEC）间的紧密连接、脑 MVEC 与星形胶质细胞、周边细胞和血管周围小胶质细胞间的紧密连接以及细

4、胞外连续的基底膜和细胞外基质等构成。其中，脑 MVEC 间的紧密连接是血脑屏障最重要的结构基础）并且能够使得氧化还原过程反复进行。在它有益的性能当中，能作为一种抗氧化剂，减少tau蛋白聚集，改善能量代谢。这些行为对于由tau蛋白聚集（tau蛋白病）引起的神经变性的疾病治疗特别有益。本研究揭示了tau蛋白病在P301S小鼠模型中亚甲蓝的影响。4mg/kg 亚甲蓝（低剂量）、40mg/kg亚甲蓝（高剂量）给予1月到10月的老鼠灌胃。我们对行为，tau蛋白病理，氧化损伤，炎症以及线粒体的数量进行评估。MB改善了P301S小鼠行为的异常，降低了tau蛋白的病理情况，炎症，氧化损伤。这个有益的影响与Nr

5、f2/ARE（抗氧化应答元件）调控的基因表达量的增加相关，Nrf2/ARE在抗氧化防御，组织蛋白聚集，降低炎症上面扮演着重要的角色。Nrf2/ARE基因的激活在其他神经退行性疾病转基因小鼠模型中是一种神经保护，并且看上去它在P301S小鼠模型中亚甲蓝的神经保护影响是一个重要的媒介。此外，我们针对于成纤维细胞利用Nrf2基因敲出技术以表明Nrf2/ARE基因由于亚甲蓝的上调是Nrf2的依赖性而不是化合物的继发效应（指不是由于药物直接作用产生，而是因药物作用诱发的反应，如果没有这个Nrf2这个基因，加入亚甲蓝也不好使，有了这个基因，加入亚甲蓝有作用，所以说是对Nrf2是一种依赖性，但不是继发效应）

6、。这些发现提供了进一步的证据表明，亚甲蓝具有重要的神经保护作用，可能有利于人类神经退行性疾病tau蛋白病理的治疗。介绍：神经退行性疾病涉及病态的tau蛋白聚集统称为tau蛋白疾病，包括AD PSP PD 与17号染色体相关联的帕金森额颞叶痴呆，慢性创伤性脑病以及关岛型-帕金森综合征-痴呆复合征。（AD：阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征

7、性病理改变为淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。病理学上以神经细胞内神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)和细胞外老年斑(Senile plaques，SPs)形成为主要特征。NFTs由许多互相缠绕细丝形成的成对螺旋状结构(Paired helical filament，PHF)组成，其主要成分是过度磷酸化的微管相连Tau蛋白。SPs主要由 淀粉样蛋白(amyloid peptide，A)的过度沉积而形成，A是一种由3943个氨基酸组成的多肽，由淀粉样蛋白前体蛋白(amyloi

8、d precursor protein，APP)经分泌酶及分泌酶水解生成。Tau蛋白异常过度磷酸化在聚集成NFT的过程中和AD神经细胞退行性变性中起着非常重要的作用。 1 Tau蛋白磷酸化与ADTau蛋白是一种神经元微管相关细胞骨架蛋白，正常情况下广泛存在于神经元内，轴突含量很高。Tau蛋白基因位于17号染色体长臂(17q21)，全长约为100 kb，共包含16个外显子。由Tau蛋白基因编码，通过对外显子2、3、10选择性剪切而产生6种不同的mRNA，最后翻译成6种不同的Tau蛋白异构体。成年人脑组织中同时表达6种Tau蛋白异构体，而在胎儿脑中仅存在最短的Tau蛋白异构体。这些异构体分子量在5

9、064 kD之间，分别由352、381、383、410、412和441个氨基酸残基组成。它们的区别在于C末端是否含3或4个由3132个氨基酸残基组成的微管结合区以及N末端存在或缺失2958 个氨基酸残基构成的插入序列。Tau蛋白通过C末端的微管结合区与微管结合，促进微管的组装，并参与轴突运输。N末端称为外伸结构域，它从微管表面外伸出来，与其他细胞骨架成分和细胞膜接触，在维持轴突的稳定中发挥重要的作用2。Tau蛋白的生物学功能是催化微管装配和稳定微管结构。在正常状态时，磷酸化强度是由蛋白激酶(催化磷酸化反应)和蛋白磷酯酶(催化去磷酸化反应)的相对活性来调节的。AD病人脑中Tau蛋白可以分成三种形

10、式：胞浆非异常磷酸化Tau蛋白(CTau);可溶性的异常磷酸化tau蛋白(AD pTau);不可溶的异常磷酸化tau蛋白(PHFTau)。正常的Tau蛋白是一种含磷蛋白质，其磷酸化程度为每摩尔蛋白2 mol磷，而PHFTau的磷酸化程度达到每摩尔蛋白8 mol磷。到目前为止在PHFTau中已发现37个丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基磷酸化位点3。Tau蛋白的过度磷酸化促使Tau蛋白聚集形成成对的螺旋状纤维丝结构,并使Tau蛋白及其他微管相关蛋白从微管释放,从而导致细胞骨架异常,轴浆运输障碍。因此，PHFTau在AD及其他Tau相关性神经退行性疾病的病理机制中起重要作用4。临床病理学研究发

11、现AD患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的NFT数量呈正相关。蛋白磷酸酯酶介导的Tau蛋白去磷酸化是维持细胞内磷酸化和去磷酸化平衡的关键因素,因此蛋白磷酸酯酶的活性降低或功能障碍是神经退行性疾病细胞内出现Tau聚集的原因之一 PSP：进行性核上性麻痹是以脑桥及中脑神经元变性及出现神经元纤维缠结(NFT)为主要病理改变的进行性神经系统变性病。由于本病有头部过伸的肌张力障碍姿势及眼球运动障碍，也称为眼颈肌张力障碍 PD：皮克病是罕见的缓慢进展的认知与行为障碍性疾病。Pick(1892)首先描述了一组以额颞叶萎缩为病理特征的病人，表现为行为异常、失语和认知障碍等。Alzheimer(1911)首次进行

12、组织病理学观察，发现神经元胞质内嗜银包涵体，称为Pick小体，弥散性肿胀及染色质松散的神经元称为Pick细胞(Picks cell)，伴额颞叶局灶性萎缩，这些病例在组织学上与Alzheimer病明显不同，无神经原纤维缠结和老年斑。近年来痴呆性疾病的研究进展较快，皮克病目前已归入额颞痴呆。本病脑萎缩主要限于额颞叶，临床表现为器质性精神异常，与Alzheimer病常难以区别，额颞痴呆病人仅约1/4存在Pick小体，可诊断皮克病。）tau蛋白是一种微管相关蛋白（MAP ），它主要表达于中枢神经系统（CNS） ，并负责微管的聚合和稳定。但是，疾病状态下的tau蛋白在非原生构象下发生突变，错误折叠以及聚

13、集。这有助于tau蛋白在正常生理活性下降低，并与tau蛋白的毒性功能发生障碍。tau蛋白聚集到丝状和非丝状的包裹体内，疾病的临床表现在随着tau蛋白病大脑区域的特异性和性状的改变而改变。tau蛋白聚集又被称作神经元纤维缠结（NFTS），tau蛋白寡聚体在增龄性的神经退行性疾病上面有助于大脑功能障碍和退化 。tau蛋白的寡聚物能够在神经元之间传输，可能在tau蛋白相关疾病中发挥关键作用。大量研究表明氧化应激和炎症在与tau蛋白相关的神经退行性疾病中发挥着至关重要的作用。氧化应激反映了一种在氧化还原反应平衡中的破坏，无论是氧化剂产量的增加还是抗氧化物的减少。它能够导致DNA 蛋白质和脂质的损害，随

14、后导致细胞功能障碍而死亡。对于DNA蛋白质和脂质的氧化损伤证明了氧化损伤发生在AD的早期。发炎，另一方面，是细胞损伤的反应。提高tau蛋白病并且加剧了疾病的病理情况。因此，刺激抗氧化剂和抗炎途径是对于tau蛋白病的治疗有着巨大的作用。亚甲基蓝是一种吩噻嗪，以其跨越血脑屏障的以及发挥神经效应的能力而闻名，这使它 对于神经退行性疾病的潜在治疗更加引人注目。亚甲基蓝作为一种治疗剂，在临床应用上面，包括对抑郁症、癌症、高铁血红蛋白血症和AD的治疗，有着很长的历史。 在所有的有益的性能中，亚甲基蓝使氧化还原循环进行，并且能够作为一种电子供体。它能够阻止tau蛋白在体外聚集，并且在tau蛋白病理学秀丽线虫

15、模型中能够降低tau蛋白聚集的数量。最近研究表明，其氧化半胱氨酸残基的能力证明了其抑制tau蛋白聚集的能力。用NMR光谱学分析，表明亚甲蓝把tau蛋白的半胱氨酸中的巯基氧化成次磺酸，亚磺酸和磺酸，同时保持tau蛋白在一个单体状态下并且阻止错误的折叠。强有力的证明，这种机制来源于用其他氨基酸 取代tau蛋白中的半胱氨酸，从而导致tau蛋白仍然在聚集，但在这样的情况下，亚甲基蓝就不再阻止聚合了。亚甲基蓝还能抑制一氧化氮合成酶，减少氧化损伤，诱导自噬，改善线粒体功能细胞呼吸细胞行为，增加tau蛋白病的潜在治疗。初步研究表明亚甲基蓝阻止tau蛋白聚集导致AD的第二期临床试验有个有希望的初步结果，而现在

16、正在进行第三阶段的临床试验。现在研究评估了P301s转基因小鼠模型中亚甲基蓝的神经保护性影响（日常 低剂量：4mg/kg；高剂量：40mg/kg）。P301S转基因小鼠和野生型小鼠同窝随机分配到空白组，亚甲基蓝低剂量组和高剂量组。日粮从1到10个月随意提供。P301S转基因小鼠表达P301S的突变基因 产生了编码人微管相关蛋白tau的基因。改善了这些小鼠的行为缺陷，神经元纤维缠结，tau蛋白病的病理特点。我们发现亚甲基蓝改善了行为异常,降低了tau蛋白病,降低了氧化应激,炎症,提高了P301小鼠模型中的线粒体的生物合成 ,并且这些神经保护的效应与Nrf2/ARE的激活基因表达量的增加相关结果：

17、 亚甲基蓝改善了P301S小鼠模型的行为缺陷低剂量的亚甲基蓝改善了运动异常,去抑制（disinhibition）(不知道是翻译成去抑制还是失控，去抑制影响运动，本能，情感，认知和感性方面，其症状、体征和狂躁症的诊断标准相似。性欲亢进，食欲过盛以及侵略性的爆发是去抑制本能的驱动)以及认知障碍。一些行为测试，包括旷场试验。（ 旷场实验（Open field test)又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央

18、区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，旷场实验视频分析系统也可观察由此而产生的焦虑心理。中枢兴奋药物可以明显增加自主的活动而减少探究行为，一定剂量的抗精神病药物可以减少探究行为而不影响自主活动。配以smart软件记录动物5-15min内的各种参数，包括：水平移动距离，在中央区域和边缘停留的时间，梳理次数等，离线分析时，分别以旷场中央和边缘来计算分析以上参数，动物在中央活动的次数反映了焦虑的程度，即中央活动次数越多焦虑越少），高架十字迷宫（高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭

19、臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开臂的次数与时间，十字迷宫距离地面较高，相当于人站在峭壁上，使实验对象产生恐惧和不安心理。）以及条件性恐惧实验（条件性恐惧分析系统（FCS）也叫场景恐惧分析系统，用于小型啮齿类动物（大、小鼠）环境相关条件性恐惧实验研究。啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动状态（freezing），动物在这种情况下倾向于保持静止不动的防御姿势。抗抑郁药和抗中枢兴奋药可以明显缩短不动状态持续的时间。实验过程中

20、，实验对象被给与一个声音信号（条件刺激），随后给予电击（非条件）刺激。该训练称为条件性训练，训练结束后实验动物进行声音信号或环境联系性实验。一般情况下啮齿类动物对相应的环境和不同环境下同样的声音信号都会做出明显的条件性恐惧反应，如静止不动。这种测试可以在训练结束后立刻或几天后进行可以提供在条件信号影响下短期和长期记忆的信息。） 就是用来说明亚甲蓝在这些异常行为上的效应（图1）。这个运动和探索是在5个月7个月以及9个月龄开放领域进行测试的（是否就是旷场试验？）。空白组P301S小鼠和野生空白小鼠对比，表现出了极度的活跃，在一个旷场试验中暴跳情况（rearings）以及移动的距离显著的增加情况表现

21、出来的（图1A和B）。这样的行为异常是通过MB低剂量饮食来提高的（图和）。用7到9月龄的小鼠进行高架十字迷宫实验来测试小鼠的焦虑状态。4min的试验时间，来测试小鼠进入开放臂的次数。用7到9月龄的小鼠利用高架十字迷宫实验来测试焦虑和探索实验。4min实验内，在开放臂花的时间和进入这个臂的次数作为测试。P301S小鼠用空白对照喂养与野生型的空白对照小鼠喂养进行比较，焦虑都有显著下降，通过小鼠在开放臂上探索的时间，以及进入那个臂的总次数的增加（图1C和D）。低剂量的MB改善了焦虑和探索相关的异常行为（图1C和D）。 高架十字迷宫 高架十字迷宫 旷场试验9月龄，学习和记忆功能通过情景惊厥条件反射实验

22、，就是在中性的环境下有害的电击休克刺激。小鼠不动持续的时间的百分比作为一种恐惧反应的检测指标测试第一天的获得阶段，组间没有显著的差距（图1E）。然而，空白对照组P301S小鼠也野生空白对照组小鼠相比较，在第二天的测试持续阶段，前者不动的时间显著少，这就意味有害的刺激与环境之间的关系的这个记忆能力受损。有趣的是，P301S低剂量组和P301S空白对照组相比在学习和记忆上面表现了显著的提升，这就表示，在保留阶段第二天的测试中，百分比不动时间有了一个显著的提升（图1F）。亚甲蓝在性别依赖性上影响行为行为数据的性别比例进一步透露，往往发生在雄性低剂量的P301S小鼠中，明显比雌性低剂量的小鼠，更明显的

23、改善了行为的异常。在开放性的领域中，雌性的P301S空白对照组与野生的空白对照组相比，暴跳的次数有显著的增加。雄性的低剂量的和P301S小鼠和空白对照P301S小鼠相比，在暴跳的次数和移动的总距离上面都有显著的降低（补充材料）。然后，低剂量的雌性P301S小鼠暴跳的次数有减少的趋势（P=0.0787补充材料，表S1A）。在高架十字迷宫实验，雄性雌性的空白对照P301S小鼠和野生的空白对照组的小鼠比较显著增加了焦虑，这个是通过小鼠在一起的开放臂花费的时间来得出的。（补充材料S1A）。雄性的低剂量的P301S小鼠与空白对照组比较。在焦虑上表现了一个显著的减少。空白对照的雄性小鼠比雌性的野生空白对照

24、小鼠显著的极度活跃，通过进入仪器中的那个臂中的增加量，然而，雄性的低剂量的P301S小鼠于空白对照的P301S雄性小鼠相比，活跃程度又显著减少。（补充材料）。在雌雄小鼠中是不可见的。条件性恐惧实验中，在第一天组间差距不显著，甚至是性别比例数据。在第二天的保留期，P301s雌性和雄性的空白对照组合野生的雌性和雄性的空白对照组相比，明显减少了受惊吓以后的不动时间。（补充材料表S1A）雄性的低剂量的P301S和空白对照组相比僵硬时间有增强的趋势。（补充材料S1A）。请注意，因为得到的统计信息数据结果太低，所以，没有对性别比例进行另外的分析。喂高剂量的MB能让P301S雄性小鼠增加体重对于所有的组，饮

25、食消耗的测量在5 7 9月龄。在任何一个组间，食物的消耗没有显著的区别（补充材料S1C）测量体重在5 7 9月龄。雄性P301S小鼠空白对照组与野生空白对照组相比，体重显著减少。然而，MB高剂量饮食上对于雄性的P301S小鼠和空白对照组的相比，能增加体重。雌性小鼠的组间在体重上面没有显著的区别（补充材料表S1B）。在P301S小鼠模型中，亚甲蓝减少tau蛋白为了了解MB在微管相关蛋白疾病中的作用，利用AT-8抗体进行脑切片染色，AT-8是一种人的tau蛋白抗体，可以检测成对螺旋丝状的tau蛋白(图2 ser202/thr205)。就如预期的一样,AT8免疫反应情况,P301S组比野生组相比要高

26、.因为tau蛋白病理学在野生小鼠中不存在,在P301S大脑切片中AT8免疫染色定量分析(免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照

27、射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。)。用MB低剂量P301S治疗和空白对照组相比,在大脑皮层的免疫反应中表现了显著的减少(图2A和B)。P301S小鼠模型中低剂量和高剂量组与空白对照组相比较,在海马区域的AT8免疫反应中表现了显著的减少.(免疫反应性 指抗原分子能与相应免疫应答的产物 ( 抗体或致敏淋巴细胞 ) ，在体内或体外发生特异性结合的性能。又称为抗原性)(图2C和D)。利用weste

28、rn blot技术使用野生空白对照组小鼠,P301S空白对照组,P301S低剂量和高剂量组中大脑皮层中的AT8抗体,评估磷酸化的tau蛋白水平, 与组织学分析一致,磷酸化的tau蛋白在空白对照的野生组中不存在.P301S喂以低剂量的MB，和野生空白对照小鼠相比，tau蛋白的磷酸化程度，有显著的增强，然而，P301S喂以低剂量的和P301S的相比，tau蛋白的磷酸化程度表现出了显著的减少（图2F）。综合来看,大脑皮层里面的AT8蛋白在western blot上面的数据证实了免疫组化中大脑皮层的AT8数据.MB在P301S小鼠模型中降低了星形胶质细胞增生（星形胶质细胞，是脊椎动物脑中的一种星状的胶

29、质细胞。脊椎动物中枢神经系统中呈星形的神经胶质细胞，可调节细胞外离子和化学环境，支持脑血屏障，为神经组织提供营养物质，并在大脑瘢痕修复中起重要作用。星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。在用尼氏法等一般染色组织切片中，星形胶质细胞的核比其他胶质细胞的核大，呈圆形或卵圆形，常染星形胶质细胞瘤色质多，异染色质少而分散，故染色浅，核仁不明显。胞质中没有尼氏体，但具有一般的细胞器。胞质中含有大量交错排列的原纤维，伸

30、人到胞突中并与胞突平行行走，是构成细胞骨架的主要成分。原纤维的超微结构是一种中间丝，称为胶质丝(glialfilament)，其直径介于微管(25m)和微丝(6m)之间，由相对分子质量为4700050000的蛋白质组成，此类蛋白质被称作为胶原原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)。利用细胞免疫法证明GFAP仅存在于星形胶质细胞的胞体中，因此可利用GFAP的特异性抗体来检测星形胶质细胞。） 星形胶质细胞 星形胶质细胞增生反映中枢神经系统损伤和炎症。用胶质纤维酸性蛋白抗体使用免疫组化分析大脑皮层和海马区域中星形胶质细胞增殖。（图3）。任一一组的大脑皮层中胶

31、质纤维酸性蛋白几乎没有阳性染色。空白对照组P301S小鼠的海马组织与野生的任一一组对比，胶质纤维酸性蛋白免疫反应有所增加。P301S无论是低剂量的还是高剂量与空白对照组相比，胶质纤维酸性蛋白的免疫反应显著降低。（图3A和B）。胶质纤维酸性蛋白mRNA水平利用qRT-PCR来测定。与免疫组化分析一致，空白对照组的P301S小鼠模型与野生空白对照组相比，海马组织和大脑皮层组织中的胶质纤维酸性蛋白在mRNA水平上面明显增强。低剂量的于空白对照组的P301S小鼠相比，大脑皮层中的胶质纤维酸性蛋白的mRNA水平显著降低。Western blot 用来检测大脑皮层组织中胶质纤维酸性蛋白的蛋白水平。P301

32、S空白对照组与野生的空白对照组相比，大脑皮层中的胶质纤维酸性蛋白的蛋白质水平明显增加。（图3E和F）。低剂量的小鼠与空白对照组相比，GFAP的蛋白质水平显著降低。这些数据与大脑皮层组织中的免疫组织化学结果与qRT-PCR结果一致。在P301S小鼠模型中，亚甲蓝降低氧化应激，促进线粒体的生物合成氧化应激是tau蛋白的一个性能特征。在大脑皮层以及海马组织中，利用8羟基脱氧鸟苷抗体，运用氧化应激免疫组化分析DNA氧化损伤（图4）。P301S小鼠空白对照组的大脑皮层和海马 与野生的任一 一组相比，都增加了8羟基脱氧鸟苷的染色（图4A和C）。低剂量的MB或者高剂量的与P301S空白对照相比，在大脑皮层和

33、海马组织中，显著降低了8羟基脱氧鸟苷的染色（图4C和D）。负责维持细胞的氧化还原平衡的内源性抗氧化剂系统，也作为评估氧化应激的一个指标。利用HPLC耦合质谱测定大脑皮层组织中重要的一种细胞抗氧化剂，就是谷胱甘肽。P301S低剂量小鼠和空白对照组的小鼠进行对比，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值显著增加，表明MB治疗的小鼠还原型谷胱甘肽有较高的水平。（图4E）氧化还原蛋白质也被分析了。在大脑皮层和海马区域中，通过定量RT - PCR分析在mRNA水平上的硫氧还蛋白1，硫氧还蛋白还原酶-1，硫氧还蛋白2，硫氧还蛋白还原酶2，谷氧还蛋白1 ，谷氧还蛋白2 和过氧化物酶6 的情况（图5） 。在大脑皮

34、层中，低剂量的P301S小鼠与空白对照组的小鼠相比，mRNA水平上的Trx1和TrxR1显著增加（图5A）。在海马区域中，低剂量的P301S与空白对照组P301S小鼠相比，在mRNA水平上，Trx1, TrxR1, Trx2, TrxR2, Grx1, Grx2 和 Prx6显著增加，而高剂量的P301S小鼠和空白对照组小鼠相比，Trx1, Trx2, TrxR2, Grx1 和 Prx6显著增加。（图5B）MB已经被证实能够增加线粒体的功能。线粒体的生物合成是通过测定mtDNA的拷贝数来衡量的，这个拷贝数与线粒体的数目相关。低剂量的P301S和空白对照组的小鼠相比，mtDNA拷贝数显著增加，

35、证明，在这些小鼠中，提高了线粒体的生物合成（图6A）。超氧化物歧化酶活性的水平，是参与细胞抗氧化防御以及Nrf2转录因子的控制的关键酶，同时也能够评定这个情况。低剂量的P301S小鼠与P301S空白对照小鼠相比，SOD活性显著增加（图6B）。亚甲蓝上调P301S小鼠的Nrf2/ARE基因Nrf2/ARE信号通路参与抵御氧化应激，炎症，以及神经保护作用。相反，炎症过程有助于tau蛋白病神经退行性疾病。MB激活了典型的基因的表达，这个基因是通过Nrf2/ARE信号通路激活的（图7）。Nrf2在mRNA水平表达，通过RT-PCR技术测定大脑皮层以及海马组织中HO1，NQO1，Gclc，Gclm以及i

36、NOS的表达。在大脑皮层中，P301S高剂量的小鼠和空白对照组小鼠进行对比，Nrf2以及HO1在mRNA水平显著增加（图7A）。在海马中，低剂量的或者高剂量的和空白对照组相比，Nrf2的mRNA水平显著增加（图7B）。空白对照组P301S和低剂量的相比，HO1在mRNA水平上面显著增加，高剂量的和空白对照组相比，NQO1 Gclc 和Gclm 都显著增加了（图7B）。在大脑皮层中，P301s低剂量的小鼠与空白对照组相比，iNOS mRNA水平上，显著下降（图7A）。在海马中，空白对照P301S与野生空白对照相比，iNOS mRNA水平上显著增加（图7B）。然而，低剂量的P301S小鼠再和空白对

37、照小鼠比较，iNOS mRNA水平上检测又显著下降（图7B）。而且，高剂量的和空白对照小鼠相比，大脑皮层、海马中iNOS mRNA水平上显著降低（图7B）。无论是低剂量的还是高剂量的P301S小鼠中，免疫组化染色实验显示MB引起Nrf2从细胞质中移动到细胞核中（图7C）。低剂量的和高剂量的于空白对照相比，Nrf2的免疫反应性都增强了（图7c）。而且，在空白对照组中，染色弥散在细胞质中，而无论是在低剂量组还是高剂量组染色较深的出现在细胞核中（图7C）。进一步表明，MB激活了 Nrf2/ARE这个信号通路，我们利用野生型Nrf2和基因敲出小鼠胚胎成纤维细胞。MB治疗诱导了HO1, NQO1 和Gc

38、lc在Nrf2 WT MEFs中的转录，但不是Nrf2基因敲除的MEFs中。（图8A）用0.1，1或者10mM MB 治疗Nrf2 WT MEFs与用vehicle治疗的相比 ，显著增加 HO1的 mRNA 水平。然后，HO1 在mRNA水平上的检测 用以0.1 ，1 或者10mM MB刺激Nrf2 KO MEFs时，却没有什么变化（图8A）。10mMB与用vehicle相比，刺激的Nrf2 WT MEFs，显著增加了NQO1在mRNA水平上的表达，用0.1或者1mM MB刺激有个NQO1 mRNA水平表达上升的趋势(图8A)。NQO1 在mRNA水平上的检测 用以0.1 ，1 或者10mM

39、MB刺激Nrf2 KO MEFs时，却没有什么变化（图8A）.用vehicle刺激和0.1 、1 和10mM MB刺激Nrf2 WT MEFs相比Gclc在mRNA水平上面的表达显著提升。而，0.1 、1 和10mM MB刺激Nrf2 KO MEFs在mRNA水平上面的表达却没有什么变化。 （Habituation：习惯性； Post-shock：休克后； Retention：保留，持续）图1说明：P301S小鼠模型中MB提高行为缺陷（A） 暴跳的数目（B） 开放领域移动的距离 野生空白对照组（n=10） 野生低剂量（n=14） 野生高剂量组（n=15） P301S空白组（n=11） P301

40、S低剂量MB组（n=15） P301S高剂量MB组（n=13）P301S空白对照组与野生空白对照组相比，在开放领域实验中，表现了更显著的活跃。（Fishers PLSD，*P0.05）P301S低剂量的与P301S空白对照组的相比，活跃表现出了显著减少（Fishers PLSD，*P0.05）（C）在开放臂中花费的时间实验中（D）高架迷宫实验进入的总次数 野生空白对照组（n=9） 野生低剂量（n=14） 野生高剂量组（n=15） P301S空白组（n=10） P301S低剂量MB组（n=15） P301S高剂量MB组（n=13）P301S空白对照组与野生空白对照组相比，在高架迷宫试验中更显著的

41、活跃以及disinhibited（Fishers PLSD，*P0.05）。低剂量的P301S小鼠与空白对照组相比，显著降低了行为的异常。（E）第一天的僵硬时间比（F）第二天的条件反射实验 野生空白对照组（n=10） 野生低剂量（n=14） 野生高剂量组（n=15） P301S空白组（n=9） P301S低剂量MB组（n=14） P301S高剂量MB组（n=12）第一天组间没什么显著区别。P301S空白对照和野生空白对照相比，第二天的保留期在记忆力上面表现了显著的降低（Fishers PLSD，*P0.05）低剂量的P301S小鼠和空白对照组在第二天的测试试验中，在学习和记忆力上表现了显著的增

42、强。（Fishers PLSD，*P0.05） 图2说明： MB在P301S小鼠模型中降低了tau蛋白病。（A） 在大脑皮层中的AT8免疫反应性（C）空白对照野生小鼠，低剂量和高剂量。P301S小鼠中空白对照组，低剂量组，和高剂量组的海马区。（B） AT8大脑皮层中的定量染色（C） P301S空白对照组（n=4）低剂量（n=5）高剂量（n=5）海马区。低剂量和空白对照组相比，MB在大脑皮层和海马区显著降低tau蛋白病P301S高剂量和空白对照组相比，MB在海马区明显降低了tau蛋白病。（E）AT8 Western blot（F）过度磷酸化的tau蛋白定量分析，以-actin作为内参。光学密度标

43、准化 P301S空白对照与野生空白对照相比，tau蛋白的过度磷酸化程度明显增加。低剂量的与P301S空白对照相比，tau蛋白的磷酸化程度显著降低。（Fishers PLSD，*P0.05）图3说明：MB在P301S小鼠模型中减少了星形胶质细胞的聚集。（A） 野生空白对照组，野生低剂量，野生高剂量，P301S的空白对照组，低剂量，高剂量组的海马体中GFAP的免疫反应性。（B） P301S小鼠空白对照（n=5），低剂量（n=7），高剂量（n=7）组海马体中，视觉染色分析。数据表明1 最低的免疫反应性 2温和的免疫反应性 3中等的免疫反应性 4 大量的免疫反应性P301S低剂量和高剂量组与空白对照组

44、相比，MB减少了GFAP表面上的水平程度。（C）大脑皮层中GFAP mRNA水平（D）野生空白（n=4）野生低剂量（n=5）野生高剂量（n=5）以及P301S的空白对照组（n=4），低剂量（n=5），高剂量（n=5）中海马区. P301S空白对照组与野生空白对照组相比，GFAP在mRNA水平上显著增高。P301S小鼠低剂量的和空白对照组相比，大脑皮层中GFAP显著减少。（Fishers PLSD，*P0.05）（E）GFAP Western blot（F）-actin 内参 P301S空白对照与野生空白对照相比，GFAP蛋白质水平显著增加。低剂量的与P301S空白对照相比，GFAP蛋白质显著减

45、少（Fishers PLSD，*P0.05）图4说明：MB在P301S小鼠模型中降低氧化应激（A） 大脑皮层中8-OHdG免疫力反应性（C）野生空白对照，低剂量，高剂量组以及P301S空白对照，低剂量，高剂量组，海马区中8-OHdG免疫力反应性（B）视觉分析大脑皮层染色情况（D）视觉分析P301S空白对照（n=5），低剂量（n=7），高剂量（n=7）海马区染色情况（C） 数据表示为 1 最低的免疫反应性 2温和的免疫反应性 3中等的免疫反应性 4 大量的免疫反应性P301S小鼠低剂量和高剂量的与空白对照组相比，MB减少了DNA的氧化损伤。（E）野生空白对照（n=5），野生低剂量（n=5），野生

46、高剂量（n=5），P301S的空白对照组（n=5），低剂量（n=5），高剂量（n=4）组中，大脑皮层的谷胱甘肽水平情况。低剂量的P301S组与空白对照组相比，MB增加了，减少氧化的谷胱甘肽的比率（GSH/GSSG）。图5说明：MB增加了P301S小鼠中氧化还原的表达。（A） 氧化还原mRNA水平在大脑皮层中的情况：野生空白对照（n=4），野生低剂量（n=5），野生高剂量（n=5），P301S的空白对照组（n=4），低剂量（n=5），高剂量（n=5）组中（B） 海马中的情况：野生空白对照（n=4），野生低剂量（n=5），野生高剂量（n=5），P301S的空白对照组（n=4），低剂量（n=5），高

47、剂量（n=5）组中.P301S低剂量组与空白对照组相比，MB明显增加了大脑皮层组织中 Trx1和TrxR1的表达。（Fishers PLSD，*P0.05）低剂量和高剂量P301S组和空白对照组相比，在海马区，MB显著增加了Trx1,Trx2, TrxR2, Grx1 和Prx6的表达（Fishers PLSD，*P0.05）。P301S低剂量和空白对照组相比，TrxR1 and Grx2也增加了（Fishers PLSD，*P0.05）。图6说明：在P301S小鼠模型中MB促进抗氧化防御（A） mtDNA复制数目野生空白对照（n=5），野生低剂量（n=5），野生高剂量（n=8），P301S的

48、空白对照组（n=5），低剂量（n=5），高剂量（n=6）组中P301S低剂量组和空白对照组相比，MB显著增加了mtDAN的复制（Fishers PLSD，*P0.05）。（B）SOD抗氧化物酶活性水平，野生空白对照（n=5），野生低剂量（n=7），野生高剂量（n=7），P301S的空白对照组（n=5），低剂量（n=7），高剂量（n=6）组中.P301S低剂量和空白对照组相比，MB显著增加了SOD的活性（Fishers PLSD，*P0.05）。讨论：细胞内环境中的还原和氧化反应即氧化还原反应，影响了细胞内的信号，可以诱导细胞的增殖，分化和死亡。氧化还原反应的失衡包括氧化物的种类增多，抗氧化物的

49、能力下降，导致对于DNA，蛋白质和脂类有害的氧化应激反应。脑组织是对于氧化应激反应具有显著的敏感的组织，与其他组织相比，脑组织耗氧量增加，更高的脂类含量以及更少的抗氧化物。越来越多和氧化损伤有关的老年痴呆和衰老证明了这个事实。HO1，一类应激诱导蛋，氧化损伤的另一标志，集中出现在阿兹海默症（AD）、额颞叶痴呆、皮质延髓退化和进行性核上性麻痹疾病的相关损伤区，这表明在在AD和其他tau蛋白病中存在氧化应激反应。P38信号通路被氧化应激激活，在 PD 和 PSP中P38磷酸化水平升高，存在于皮克小体，NFTs和神经纤维网络中。炎症发展也有助于AD的发展。虽然，口服抗氧化剂和抗炎化合物对氧化应激有不

50、利影响，它们迄今在治疗tau蛋白病中，还没有成功。因此，这两种内源性的抗氧化以及抗炎症系统的转录刺激，用来产生协调一致的反应可能是一个更有效的办法。在本文中，我们研究了在P301S转基因小鼠疾病进程中MB的作用。这种老鼠过表达一种人类MAPT的突变形式，发展了小鼠的行为缺陷，包括亢奋，去抑制和微管蛋白相关的神经病理学症状。在这一模型中，突触不足，小神经细胞激活，氧化损伤和线粒体功能障碍在NFT生成前发生。MB，又叫亚甲蓝，是一种吩噻嗪，氧化还原化合物，可以作为电子的供体和受体。由于它可以轻松的通过血脑屏障，因此它具有治疗神经退行性疾病的巨大潜力。MB具有毒物剂量响应，它发挥作用的最佳浓度为低浓

51、度到中等浓度范围。它在较低剂量时表现为促进能量代谢和抗氧化，在高剂量时则表现为降低能量代谢并表现为氧化物前体。同样的，4 mg/kg实验组中，在记忆提高实验和脑中氧消耗量实验中MB也存在剂量依赖，10 mg/kg实验组却不太一致。近年来报导了不少MB在治疗微管蛋白相关病理学体内实验的疗效。在一种斑马鱼模型中，MB不能减轻微管蛋白相关疾病的症状，不能减少神经元损失，也不能改变其游泳的行为。在秀丽隐杆线虫中表达微管蛋白前体，MB可以减少不溶解的微管蛋白并增强移动能力。在P301L转基因小鼠中，在海马组织中注射1 mM的MB可以增强其在Morris水迷宫实验（Morris水迷宫实验是一种强迫实验动物

52、（大鼠、小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉（空间定位）的学习记忆能力。实验方法：（1）将动物（大鼠或小鼠）头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（s）。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s.（2）将动物移开、擦干。必要时将动物（尤其是大鼠）放在150W的白炽灯下烤5min，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔1520min,连续训练5d。（3）最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对

53、侧放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标.（4）测定动物的工作记忆（working memory）。探查训练结束后的第二天，开始维持4天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。每天训练4次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度）中的学习能力。 在其他实验中，两组P301L小鼠在饮用水中加入10 mg/kg的MB或者 vehicle连续12周，使用MB的小鼠在水迷宫实验中有明显的提高。这些都伴随着可溶性微管蛋白的减少，但是对病理学方面没有改善。MB还可以在3xTg-AD小鼠实验中提高学习和

54、记忆，诱导蛋白酶体活性，减少淀粉样蛋白，尽管对tau蛋白没有什么影响。最近的研究，给8-11月龄的P301L转基因小鼠口服MB五个月，磷酸化的非溶解性微管相关蛋白聚集明显减少。另一些研究证明，在 P301L转基因小鼠模型中，MB诱导自噬以及减少tau总蛋白、磷酸化的tau蛋白。在实验中，同窝出生的P301S小鼠和WT，1到10个月大，随机的喂食对照食物或加入4 mg/kgMB（低剂量组）的食物，加入40 mg/kg（高剂量组）的食物。MB低剂量组中在异常行为测定指标中有明显的下降，这里的异常包括亢奋、去抑制、学习和记忆缺陷。亢奋和去抑制现象在低剂量MB给药的P301S小鼠开放区域和高架迷宫实验

55、中都表现出明显的减少。而且，在MB低剂量组中恐惧条件反射实验中也表现出对学习和记忆能力的提高作用。总的来说，4 mg/kg的P301S小鼠MB低剂量组中对于所有行为方面的表现具有明显的提高，而40 mg/kg的高剂量组则没有明显的效果，也表明了MB的毒性剂量响应。著名的行为上的提升最初在雄性P301S小鼠低剂量MB给药中发现，当时这些行为数据根据性别分类。性别的分类在其他的结果和分析中并未发生，因为在统计学上这些结果的过低而无法统计。在人类和动物的神经学疾病研究中曾报道疾病具有性别差异性。.我们在前面已经展示过雄性P301S小鼠比雌性小鼠缺乏的更为明显，也许这与雌性荷尔蒙如雌激素具有潜在的保护活性有关。