淀粉液化及糖化试验

1、淀粉液化及糖化实验Hessen was revised in January 2021淀粉液化及糖化实验一、实验目的1. 掌握用酶解法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法;2. 掌握还原糖的测定方法。二、实验原理在发酵过程中，因有些微生物不能直接利用淀粉，当以淀粉为原料时，必 须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程 成为淀粉的糖化，所制得的糖液成为淀粉水解糖。水解淀粉为葡萄糖的方法包 括酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法葡萄糖可分为 两步：第一步是利用Q-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，

2、使淀粉的可溶性 增加，这个过程称为液化；第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解， 转变为葡萄糖的过程，这个过程在生产上成为糖化。淀粉的液化和糖化都是在 酶的作用下进行的，故该方法也称为双酶法。L酶解法液化原理淀粉的酶解法液化是以a -淀粉酶作为催化剂，该酶作用于淀粉的a-1,4- 糖昔键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖， 所以淀粉酶也称内切淀粉酶。淀粉受到a-淀粉酶的作用后，其碘色反应发 生以下变化：蓝色一紫色一红色一浅红色一不显色（即显碘原色）。酶解法液化因生产工艺不同分为间歇法、半连续法和连续法；液化设备分 为管式、罐式和喷射式；加酶方法包括一次加酶法、二次

3、加酶法和三次加酶 法；根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法及中温酶和高温酶混合法。 本实验釆用：高温酶法，间歇式，罐式，一次加酶法。2.酶解法糖化原理淀粉的酶解法糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单 位依次分解淀粉的a-1,4-糖昔键或a-1,6-糖昔键，山于是从链的一端逐渐一 个个地切断为葡萄糖，所以糖化酶也成为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中有水的参与反应，故糖化的理论 收率为111.1%（CsHxoOs） Q +H20 f n CeHxA162 18 180 淀粉糖化实际收率的讣算公式：淀粉糖化实际收率二糖液量（L）x糖液葡萄糖含量（g/L）-00&q

4、uot;投入淀粉量（g）x原料中纯淀粉含量（） %6淀粉转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。 淀粉转化率的计算：淀粉转化斡枚入驚辛:臨囂爲豔咙糖化液中还原糖（以葡萄糖汁）占干物质的白分比，称为DE值。用DE值 表示淀粉水解的程度或糖化程度。DE值的计算公式：nn估-还原糖含量DE偵一干物质含量X100%还原糖含量用3, 5-二硝基水杨酸（DS2O比色法测定，表示方法：g葡萄糖 /lOOmL 糖液。干物质含量用阿贝折光仪测定，表示方法：g干物质/lOOmL糖液。本实验 采用淀粉干重替代（即原料中纯淀粉含量为100%） o糖化时间与糖化酶用量的关系见表lo表1糖化时间与糖化酶用量关

5、系表糖化时间/h68101621324872糖化酶用量（U/g淀 粉）180400320240180150120100三、实验仪器与试剂仪器$光光度计、恒温水浴锅、烘箱、滴定管、酸度计、电炉、离心机、白瓷 板、烧杯、试管等。2.试剂玉米淀粉、a-淀粉酶、糖化酶、PH试纸、盐酸、葡萄糖溶液、DS试剂、 无水酒精等。磷酸-柠檬酸缓冲液（PH6.0）:称取磷酸氢二钠（Na2HP0 12H：0） 45.23 g，柠檬酸（CsHsO： < H20） 8. 07 g,用蒸憎水溶解定容至1000 mL,配好后应以 酸度计调整PH值为6.0。原碘液（存储液）：称取0.5 g碘和5.0 g碘化钾，研磨，溶

6、于少量蒸镭 水中，然后定容至100 mL,储存于棕色瓶中备用。稀碘液（工作液）：取1 m/L原碘液用蒸憎水稀释100倍（当天制备）。反应终止液：0. 1 mol/L硫酸。四、实验方法1. 淀粉的液化配置30%的淀粉乳（按照0.1 L配制）两份，调节PH值至6.5,加入氯化 钙（固形物0. 2%,钙离子的存在可以保持a -淀粉酶在水解过程中保持活力和 稳定性），加入淀粉酶（1220 U/g淀粉）；在剧烈搅拌下，先加热至 72 °C,保温15 min；再加热至90 °C,并维持30 min,中间不停止搅拌，以 达到所需的液化程度（DE值1518%）:取小样检测碘色反应呈棕红色；

7、液化反 应后，再升温至100120 °C,保持齐8 min,以凝聚蛋白质；以6000 r/min离 心5 min得到上清液。2. 淀粉的糖化迅速将上述上清液用盐酸将PH调至4旷4.5,同时迅速降温至60 °C；然 后加入糖化酶（酶活力为10000 U的酶液0.5 mL）,于60 °C保温广2 h；当 用无水酒精检验无糊精存在时，将溶液PH值调至48、50,同时，将溶液加热 至80 °C,保温20 min；然后将溶液温度降至60、70 °C,以6000 r/min离心5 min即得到糖上清液；量取该糖液体积，取样分析还原糖含量(测定方法参见 附录

8、“葡萄糖含量的测定(3, 5-二硝基水杨酸比色法)”相关内容)。五、实验结果1.在详细记录实验数据基础上完成下表，计算淀粉转化率。(1)葡萄糖含量测定 吸光度测定试剂试管编号012345lmf/mL葡萄糖溶液(mL)00.20.40.60.81. 0蒸饰水(mL)1. 00.80.60.40.20DNS 试剂(mL)333333吸光度 标准曲线绘制 葡萄糖含量计算(2)淀粉转化率测定淀粉量 (Q纯淀粉含量(%)糖液量(L)糖液栩萄糖含量(g/L)糖化实际收率 (%)淀粉转化率(%)100六、实验思考1.分析糖化酶用量对糖化效果的影响2 淀粉液化过程中儿个保温过程有何作用？附录1：葡萄糖含量的测

9、定（3, 5-二硝基水杨酸比色法）一、实验原理本实验是利用3, 5-二硝基水杨酸（DS）试剂与还原糖溶液共热后被还原 成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量和棕红色物质颜色深浅的 程度成一定比例关系，故可用于比色测定。葡萄糖与3, 5-二硝基水杨酸试剂反 应生成的有色物质在540 nm波长下有最大吸收峰，故在此波长下进行比色测 定。二、实验方法1.标准曲线的绘制取6支大试管，分别编号0、5,按下表1加入各种试剂。表1葡萄糖含量的测定试剂试管编号012315lmg/mL葡荀塘溶液（mL）00.20.40.60.81. 0蒸馅水（mL）1. 00.30.60.40.20DNS 试剂（mL）333333将各试管中溶液振荡均匀后，在沸水浴中准确煮沸5 min,将试管取出迅 速用冷水冷却至室温，加入蒸馆水15 mL,摇匀。在540 nm波长下，用0号试 管作为空白调零，测定其他试管内溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖 含量为横坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定将发酵液5 mL,以5000 r/min离心5 min