清热、解毒、散结类中药抗乳腺癌活性成分的筛选及其药理机制研究

1、清热、 解毒、散结”类中药抗乳腺癌活性成分的筛选及其药理机制研究乳腺癌为妇女最常见的恶性肿瘤， 其发病率和致死人数居女性恶性肿瘤的首 位。传统医学认为：“热者寒之”、“结者散之”的清热解毒散结法，是乳腺癌和 乳腺增生的中医治疗的基本法则之一。在检索查阅大量文献资料的基础上， 我们发现：蒲公英（28 次）、甘草（121 次）、瓜蒌（80 次）、黄药子（32次）、柴胡（149 次）、木香（ 34次），等六味“清 热、解毒、散结”类中药在治疗乳腺癌和乳腺增生的复方中经常使用，因此我们 推测这 6 味药中很可能含有抗乳腺癌活性成分。 在本研究中，我们建立了一种活 性为导向的分段筛选平台，即：半制备高效

2、液相色谱（ Semi-preparative HPLC -UV分段、人乳腺癌MCF-7细胞毒性筛选、超高效液相色谱串联飞行时间质谱 仪（UPLC-Q- TOF MS 检测。利用该平台我们快速筛选了上述六味中药的潜在抗乳腺癌活性成分， 并从木 香挥发油（VOSL中筛选鉴定出两个潜在的抗乳腺癌活性成分：木香烃内酯（Cos） 和去氢木香内酯（Dehy）。有趣的是，我们首次发现这两个化合物在体外对MCF-7细胞的增殖具有协同抑制效应。中药口服后经体内肠道菌群或肝脏代谢，往往会产生一些活性的代谢产物。 利用血清药理学的筛选方法，能同时筛选具有活性的中药原药成分和代谢产物。基于血清药理学的方法，结合活性为

3、导向的分段筛选平台，我们发现：11,13-Dihydrotaraxinic acid、Taraxinic acid B -D-glucoside 和 Ainslioside 是蒲公英中潜在的抗乳腺癌活性成分。 其中 11,13-Dihydrotaraxinic acid 以原 药的形式展现其潜在的抗乳腺癌效果，而 Taraxinic acid B -D-glucoside 和 Ainslioside 则需要通过肠道菌群介导的B -糖苷键水解，分别产生活性代谢产物 Taraxinic acid 和 Germacranolide acid 后才能发挥其抗癌活性。我们建立的这种筛选策略， 不仅能消除

4、传统血清药理学中血清内源性成分的 干扰，而且还能直观地将中药的化学成分和药理活性对应起来， 使得中药活性成 分的筛选更加迅速可靠。利用异源移植的裸鼠乳腺癌模型，我们评价了Dehy、Cos-Dehy及VOS的体内抗乳腺癌效果，并利用代谢组学的方法研究了异源移植 裸鼠乳腺癌的病理机制以及 Cos-Dehy和VOSL的药理机制。结果表明：Cos-Dehy和VOS均能显著抑制MCF-7异源乳腺瘤的生长，而Dehy 的抑制作用不明显。基于GC-M舔口 LC-MS的代谢组学技术，我们从乳腺癌裸鼠模 型血清和尿液中共发现了 118 个差异代谢物， 这些代谢物主要涉及到五条代谢通 路，即：糖酵解 / 丙酮酸代

5、谢、缬氨酸 /亮氨酸/ 异亮氨酸代谢、苯丙氨酸 / 酪氨酸 代谢、甾体激素代谢、不饱和脂肪酸代谢，其中，后两条代谢通路在其它癌症中 未见报道，可能与乳腺癌特异相关。根据这些代谢物在模型组与健康组中的差异倍数以及ROC曲线的面积，我们进一步筛选出 7 个潜在异源乳腺癌病理标志物， 即：花生四烯酸、 二十二碳六烯 酸、二十碳五烯酸、亚油酸、双高 丫亚麻油酸、20 a -羟基孕酮和皮质酮。利用 这七个生物标志物综合判别健康组和乳腺癌模型组时， 其判断的灵敏度和特异性 均达到100%同时，我们还发现 VOSL和 Cos-Dehy治疗后，乳腺癌模型组中这 几个标志物的表达水平明显恢复，向健康组靠近。因此

6、，这七个生物标志物可以为乳腺癌的临床诊断和药效评价研究提供有价值的线索。VOSL和 Cos-Dehy均能干预乳腺癌裸鼠异常的苯丙氨酸/酪氨酸代谢 通路、甾体激素代谢通路以及不饱和脂肪酸代谢通路。此外，VOSL还能调节乳腺癌模型鼠异常的能量代谢通路(包括糖酵解 /丙酮酸代谢、三羧酸循环) ，使裸鼠的体重和活力明显优于其它治疗组，因此， VOSL和Cos-Dehy均具有应用于乳腺癌临床治疗的前景。基于 TiO2-MOA(磷酸化肽富 集技术和iTRAQ标记定量技术，我们研究了 Cos、Dehy、Cos-Dehy、VOSLF预下， MCF-7细胞的磷酸化蛋白组变化，并结合细胞周期实验，揭示它们抗乳腺癌

7、的药 理机制。结果表明：VOS中的主要抗乳腺癌活性成份为 Cos和Dehy,其联合抗乳腺 癌的分子机制为：通过 AKAPg白和cAMP共同介导的蛋白激酶 A( PKA, Protein kinase A)活性下调来阻滞MCF-7乳腺癌细胞周期S期，干扰细胞骨架构建、诱 导细胞凋亡。由于Cos和Dehy是VOSL勺主要抗癌活性成分，且体内外实验均表 明联合用药的效果更佳，因此我们以大鼠为受试动物，研究了Cos和Dehy联合静脉注射给药后的药代动力学和代谢产物。结果表明：Dehy的表观分布容积与清除率要高于 Cos的表观分布容积与清 除率，而Dehy的血浆最大峰值浓度则低于 Cos的血浆最大峰值浓度。同时，这 两个化合物的药代动力学特征也有共性， 即：尽管两个化合物都有较高血浆蛋白 结合率，却有相对较大的表观分布容积和相对短的半衰期。根据这些药代特点， 我们推测， 这两个化合物应该是 “高摄取药物”，因此， 我们建议，将这两个化合物以缓 /控释剂型给药可能更有理利于维持血药浓度水 平，发挥药理活性。我们从大鼠含药血浆、尿液和粪便中鉴定出十个代谢产物。Cos在体内以二相代谢为主，而 Dehy在体内则以一相代谢为主。两个化合 物也有相同的代谢途径，