分子生物学实验

1、分子生物学实验西北农林科技大学目录一、基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、琼脂糖凝胶电泳实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析实验七、植物RNA提取、定量及电泳分析二、目的基因获取实验八、聚合酶链 式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、地高辛标记的Southern杂交实验十四、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达四、附录实

2、验报告在完成实验后，必须书写实验报告。一份满意的实验报告必须具备准确、客观、简洁、明了四个特点。写好实验报告除了正确的操作程序外，还必须有赖于仔细的观察及客观的记录，有赖于运用所掌握的理论知识对实验现象和结果的分析和综合能力。实验报告的格式包括以下几方面：1、 实验的目的和原理简单扼要地说明进行本次实验的目的和原理。对实验中所用的技术和方法，要作简单的介绍。2、实验操作程序在充分理解操作步骤和原理的基础上。对整个实验操作过程进行概括性的描述，要求简单明了，避免长篇抄录。3、结果处理对实验过程中出现的现象仔细观察，对数据客观记录。然后再进行处理计算等，得出结果。4、讨论这是实验报告中最重要的一部

3、分。首先要对实验结果的准确性进行分析确认，对实验中的误差或错误加以分析，然后综合所观察到的各种现象和数据，做出结论。在此基础上，应运用相关的理论知识及参考文献，结合实验目的、要求进行讨论。对实验中出现的新问题可提出自己的看法，并对自己的实验质量做出评价。实验一 细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基

4、中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以2030min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×1092×109/mL。培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一） 实验材料大肠杆菌（二） 试剂1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化钠4、1mol/L NaOH5、琼脂粉6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1、培养皿2、带帽试管3、涂

5、布器4、灭菌锅5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6、恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbfin2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。（二）细菌的培养（）在液体培养基中培养1、过夜培养取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。用接种环或灭菌牙签挑一个

6、单菌落，接种于培养液中。盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37过夜培养。、大体积培养按1100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。于37，约300r/min剧烈摇动培养。（）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。（见下图）于37培养直至长出单菌落。实验二 质粒DNA的提取一、目的学习碱裂解法提取质粒的原理二、原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结

7、构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭

8、合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料含质粒的大肠杆菌DH5（二）试剂1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。3、溶液：50mmol/L 葡萄糖

9、,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。4、溶液：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须新鲜配制）5、溶液：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1L乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，水 28.5ml）。6、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。7、无水乙醇和70%乙醇。（三）仪器1、Eppendorf管、离心管架2、10，100，1000 l微量加样器3、台式高速离心机4、摇床、高压灭菌锅四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37培养24小时，然后从平板

10、上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37培养12小时。（二）提取步骤1、将菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（13000rpm），倒去上清液，如收集3ml 菌液，重复一次，倒转于滤纸除净残液。2、加入100l预冷的溶液(含5ug/l RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。3、加入150l溶液，快速颠倒温和混匀，室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。4、加入150l 预冷的溶液，温和混匀（此时应有可见沉淀），在冰浴中5分钟。5、12000rpm离心3分钟。转移上清液至另一1.5ml离心管中。6、加800 l乙醇到上清液中，混匀， 12000rpm离心5分钟，除去上清（尽可能除去残液）。7、

11、用0.5ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，除去乙醇（尽可能除去残液）。8、离心干燥DNA。9、加40l TE溶解DNA，待用（或-20保存）。实验三 紫外吸收法测定核酸浓度与纯度一、目的学习测定DNA或RNA的浓度与纯度。二、原理核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。核酸的最大吸收波长在260 nm，吸收低峰在230 nm。可以利用核酸的这一特性对其浓度进行测定。在波长260 nm下，A260=1时，双链DNA的含量为50 µg/ml，单链DNA为 33 µg/ml ，RNA为 40 µg/ml，寡聚核苷酸为 2030 

12、1;g/ml。测出核酸溶液在A260的值，即可得出浓度。根据经验数据，纯得DNA A260/A280=1.8,纯的 RNA A260/A280=2.0.若样品中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。三、试剂与仪器（一）试剂 TE缓冲溶液（二）仪器 紫外分光光度计四、操作步骤1、 开机，选择波长开机前应先检查光路中有无障碍物。然后开启电源开关预热20左右。并调节波长在260 nm下。2、选择A档，调零面表上有4个可供选择的模式，本实验选择测定A值，因此选择A模式。待测核酸为水或TE溶液，选择水或TE做空白对照进行调零。3、测定样品将待测样品做适当稀释，用仪器配套的石英比色杯，以水或TE为对照的条件下

13、测定，读取并记录样品A260的值。4、 计算样品的浓度双链DNA浓度=50µg/ml×A260×稀释倍数单链DNA浓度=33µg/ml×A260×稀释倍数单链RAN浓度=40µg/ml×A260×稀释倍数核酸总量=样品浓度×样品体积（ml）实验四 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA一、目的学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。二、原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA

14、样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1ng的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在

15、用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。当然也可以用同样的方法检测RNA。三、试剂与主要仪器（一）试剂1、 DNA样品2、 TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍（配制见附录）3、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油4、 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。5、 琼脂糖（二）仪器1、 电泳仪系统2、 紫外灯3、

16、恒温水浴箱四、操作步骤1、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。2、选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.51.0mm。3、制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：琼脂糖的含量（%）分离线装DNA分子的有限范围(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。4、将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并

17、在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5微克/毫升），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：缓冲液要高出凝胶面2。5、待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量。6、开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。7、泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后电泳结束。一般20分钟至3小时，取出电泳凝胶块直接检测拍照。实验五 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分

18、析鉴定一、目的学习质粒的酶切及电泳分析。二、原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。质粒DNA在细胞内有三种构象：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；线状DNA，

19、双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现23条区带。三、试剂与主要仪器（一）试剂1、EcoR酶2、DNA3、TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5、溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6、琼脂糖（二）仪器1、电泳仪系统2、紫外灯3、恒温水浴箱四、操作步骤（一）质粒DNA酶切管号质粒DNA101010EcoR/ l11酶切Buffer（10×）/ l222

20、ddH2O/ l876RNA酶11、 按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。2、 加样后混匀，置于37水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 l Loading buffer。（二）琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65时加入2 l EB，混匀。2、胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。3、 加样每个样品中加

21、入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。4、 电泳观察接通电源，电压为80V，电泳1小时左右，当溴酚蓝到达下沿1-2处时，停止电泳。5、 观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。实验六 植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析一、目的掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。二、原理十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使D

22、NA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料小麦幼苗（二）试剂1、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不调)2、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris pH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB1

23、00ml ddH2O3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），即为抽提液。4、氯仿：异戊醇（24：1）5、70% 乙醇6、异丙醇7、Hind 酶8、EcoR酶（三）器材1、台式离心机2、恒温水浴3、紫外分析仪4、微量加样器四、操作步骤（一）基因组DNA提取1、取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700l抽提液（65预热）混匀，放入65水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。2、取出裂解好的DNA ，加入700l 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（1

24、0000rpm,10分钟）。3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀，使DNA成团，-20放置半小时以上。4、将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。5、去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50l TE或水中。（三） 酶切及电泳分析1、按照下表加入各成分。管号1234gDNA30l30lDNA3l3lEcoR1.5l1lHind 1.5l1l10×BUFFER H5l2l10×BUFFER E5l2lRnase1l1lddH2O13.5l13.5l14l14l管号1gDNA10lEcoR2l10×

25、;BUFFER3lddH2O15l2、 10000rpm离心20 S混匀，37反应4h。3、 0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。4、 观察并记录结果。实验七 RNA提取与纯化一、目的掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。二、原理RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA

26、在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180烘烤6小时以上。所有的塑料器皿用0.1的DEPC水37过夜浸泡，然后湿热灭菌80烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）

27、。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。三、试剂与器材（一）试剂1、 暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3小时2、 DEPC3、 DEPC处理的ddH2O4、 RNA提取液：（每1000毫升中含有） Tris 6.06 克 (最终浓度为50 mM ) LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克) (最

28、终浓度为150 mM ) EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最终浓度为5 mM ) SDS 50 克 (最终浓度为5 % )5、 8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O6、 水饱和酚7、 氯仿8、 0.5M NaCl9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。10、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。二、 器材1、 分光光度计2、 电泳仪3、 台式离心机4、 手提式紫外监测仪5、 恒温水浴6、 凝胶成像系统四、操作步骤1、取植物叶片1-3克，放在液氮

29、中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至110)2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯仿，剧烈（！）反复倒置混匀5至10分钟（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。4、13000g离心5分钟，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5分钟。7、13000g离心5分钟。8、取上清，加入1/3体积8 M 的 LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%

30、）， 沉淀RNA，4过夜。9、离心13000g × 10 分钟。10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒置混匀），离心 （13000g × 2 分钟）。重复洗涤沉淀数次。11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2分钟。13、加入200 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。14、取用5 ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V, 走20-30分钟。15、取5 ul稀释40倍测

31、定RNA的纯度和浓度，A260 nm /A280 nm应在 2.0 左右。16、将RNA 分装,放在-70长期保存备用.辅助方案：试剂盒提取法（SK361）（一）试剂：1、 RLT Solution2、 RW Solution3、 RPE Solution4、 DEPC-Water5、 Ethanol (100%)（二）器材：1、 UNIQ-10 Column2、 2.0ml Collection Tube3、 离心机4、 移液器（三）实验步骤1、 称取小麦叶片0.2g,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。2、 迅速加入450l RLT Solution，剧烈振荡，使样品充

32、分溶解。3、 加300l无水乙醇，温和混匀。4、 将UNIQ-10 Column 套到2ml Collection Tube上，将上述溶液转移到UNIQ-10 Column中，10000g离心1min。倒掉Collection Tube中的溶液，重新将UNIQ-10 Column 套到2ml Collection Tube上。5、 加入500l RW Solution到UNIQ-10 Column中，10000g离心1min。倒掉Collection Tube中的溶液，重新将UNIQ-10 Column 套到2ml Collection Tube上。6、 加入500l RPE Solution

33、, 10000g离心1min。倒掉Collection Tube中的溶液，重新将UNIQ-10 Column 套到一个无菌的新1.5ml离心管上。7、 加40l DEPC Water到UNIQ-10 Column中,50温浴min, 10000g离心1min,收集到的溶液即为RNA溶液。、测定RNA的浓度和纯度。实验八 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA一、目的1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。2、了解引物设计的一般要求。二、原理聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因

34、或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）引物dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）Taq DNA聚合酶反应缓冲体系PCR循环由三个步骤组成：变性 使模板DNA解离成单链；退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合；延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：引物长度：1525个核苷酸； GC含量为40%60%；Tm值为55（

35、Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；引物与非特异配对位点的配对率小于70%；引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，两条引物间配对碱基数小于5个。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。三、试剂与仪器（一）试剂1、 Taq DNA聚合酶2、 10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）3、 dNTP4、 引物（P1、P2）5、 溴乙啶 (EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0

36、.25%溴酚蓝，40%甘油。（二）仪器1、PCR扩增仪2、电泳仪3、台式离心机4、紫外分析仪5、恒温水浴6、凝胶成像系统四、操作步骤（一）PCR扩增1、按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。试剂体积（ 50l）ddH2O31.5l10 x buffer5l10×dNTP5lPrimer P11lPrimer P21l模板1lTaq 酶0.5l2、设置PCR程序： 94 180s 94 45s 30 cycles: 55 45s 72 60s 72 600s3、运行PCR程序 （二）PCR产物鉴定反应结束后，取20l PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。实验九

37、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）一、目的学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。二、原理普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因中大多包含内含子，所以从染色体DNA为模板扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。人工去除内含子是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA聚合酶，在oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用

38、于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。三、试剂与器材（一）试剂1、 RNA模板2、 cDNA引物3、 反转录缓冲液4、 dNTP5、 AMV反转录酶6、 RNA抑制剂（RNasin）7、 Taq酶8、 10×PCR缓冲溶液9、 引物（P1、P2）（二）仪器1、PCR扩增仪2、电泳仪3、台式离心机4、恒温水浴5、紫外分析仪6、微量移液器四、操作步骤（一）RNA的反转录1、在小管中依次加入5 l RNA 6 l DEPC H2O 混合后,65水浴5 分钟(破坏二级结构). 5、 置于冰浴5分钟.3、在管中依次加入: RT buffer ( 5×

39、) 4 l RNasin 1 l dNTP ( 10mM) 2 lOligo T17A（GC） 1 lAMV反转录酶1 l (反应体系为20 l) 置于 42水浴, 1 小时.4、70 5 分钟（使酶失活，可省略）.5、加入100 l TE。 6、置于-20保存备用。在以后的PCR反应中（50 ml反应体系），取5l 为模板。（二）PCR扩增DNA在灭菌的0.5ml离心管中，依次加入10l 上述反转录产物5l 10×PCR缓冲液1l 扩增引物11l 扩增引物25l dNTP1l Taq DNA聚合酶加ddH2O至50l ，混匀。按下面的设置程序进行扩增。94 180s 94 45s

40、30 cycles: 57 45s 72 60s 72 600s（三）PCR产物的鉴定取8l PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析。实验十 质粒载体和外源DNA的连接反应一、目的掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。二、原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3,5磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一

41、个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3

42、kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25 -100 ng / l。连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在1216过夜，也可在4过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。三、试剂与器材（一）试剂1、目标DNA片段（实验九RT-PCR扩增产物）2、载体（pGEMT-easy）3、2 × ligation 缓冲液4、T4 DNA连接酶5、dd

43、H2O（二）器材1、台式离心机2、恒温水浴3、微量移液器四、操作步骤1、取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:2 × buffer： 5lpGEMT-easy： 0.5l目的片段： 2.5lT4连接酶： 1lddH2O 1l5、 离心机离心30S，使反应体系充分混合。6、 4过夜连接。实验十一 感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1M CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多

44、种，入热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。三、试剂与仪器（一）试剂1、0.1mol/L CaCl2 称取无水氯花钙56g，加重蒸水至500毫升，与高压锅灭菌20分钟。2、LB液体培养基（见实验一）3、LB固体培养基（见实验一）4、氨苄青霉素（100毫克/毫升）（二）仪器1、 冷冻离心机2、 平衡天平3、 无菌操作台4、 微量移液器 5、高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)1、从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。2、挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37摇菌

45、培养12-16h(300rpm)可过夜培养。3、取1ml菌液（接种） 到50 ml LB中 (37，预热), 扩大培养。应准备两个培养物。4、约2小时开始，用一个培养测OD600值 （此培养只做测量OD600值用， OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。5、把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4 离心4000rpm, 10 分钟。 6、弃上清, 加10ml 0.1

46、M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4 离心4000rpm, 10 分钟。7、弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。置于4 存放。12小时内使用效果最佳。*注意无菌操作和保持低温。*培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。*如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。（二）质粒对大肠杆菌的转化1、取两只1.5ml离心管，分别标记为S（学号）、CK（学号）。2、分别加入100l制备好的感受态细胞，冰上放置10min。3、S管中加入1l小量制备的质粒，冰浴10min。4、42热激90S。5、冰浴3min。6、加入800l LB液体培养基，37培养

47、45min。7、取两个培养皿，分别标记为S、amp（学号，日期）；CK、amp（学号，日期）。8、取S和CK各100l 涂布在作好标记的培养皿中。9、37倒置培养16-20h。实验十二 克隆的筛选和快速鉴定一、目的掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。二、原理在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎

48、片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。三、试剂与仪器（一）试剂1、 破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)1% SDS2mmol/L EDTA400mmol/L蔗糖0.01%溴酚蓝配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10毫升 20% SDS 10毫升 250mmol/L EDTA 1.6毫升 蔗糖 27.2克 1.2%溴酚蓝 1.67毫升 加dd

49、H2O至200毫升2、 10mg/ml 溴乙啶3、 TBE电泳缓冲液（5×）4、 Taq DNA聚合酶5、 10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）6、 dNTP7、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。（二）仪器1、电泳仪2、1.5ml 离心管3、Tip 5、 培养皿6、 PCR扩增仪7、 台式离心机8、 紫外分析仪9、 恒温水浴四、操作步骤（一）快速细胞破碎法测定1、取1.5ml离心管编号码，每管加入50l破碎细胞缓冲液。2、取一培养皿在底部标记如图所示1 2 34 5 67 8 910 11 12 3、待转化

50、的细菌菌落长到2mm时4、用牙签挑取单克隆点在作好标记的方格内，然后挑同一克隆加入对应1.5ml 离心管中（离心管中已加入50微升破碎细胞缓冲液）。5、培养皿37培养6小时后4保存。6、离心管于37水浴中，保温15分钟。7、12000rpm，离心15分钟。8、取上清约25微升，进行琼脂糖凝胶电泳。（胶浓度为1%）9、紫外灯进行结果分析。（二）菌落PCR快速鉴定法1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入50l PCR反应体系中。2、用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。试剂体积（ 50l）ddH2O31.5ml10 x b

51、uffer5ml10×dNTP5mlPrimer P11mlPrimer P21l模板1lTaq 酶0.5l实验十三 地高辛标记的Southern杂交一、目的学习Southern杂交的原理及操作方法。二、原理1975年Southern发明了Southern blot分子杂交方法。这项技术包括在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的DNA；用NaOH对凝胶中的DNA进行变性处理；通过毛细管作用将单链DNA吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样

52、品基因的目的。因此，Southern印迹杂交包括两个步骤把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。与标记的DNA探针杂交。地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点

53、在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。三、试剂与器材（一）试剂1、DIG Random Labeling Mix（高效）2、Anti-DIG-AP Conjugate3、BCIP/NBT Stock Solution 4、Blocking Reagent5、20×SSC 0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl6、2