微生物实验(生物实验三)

1、生物大实验三微生物学部分实验目录实验一、 培养基的配制和灭菌实验二、 微生物的分离、接种及培养法实验三、 水中细菌总数和大肠菌群的检测实验四、 微生物的快速鉴定和自动化分析技术实验五、 抗微生物药物敏感性试验实验六、 微生物的生理生化反应实验七、 微生物菌种保藏实验八、 沉淀反应实验九、 细菌鞭毛染色及其运动的观察实验十、 细菌芽孢、荚膜的染色及观察实验一、培养基的配制和灭菌一、实验目的1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法。3.进一步熟练掌握手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。二、实验器材1.药品及试剂：可溶性淀粉，葡萄糖，

2、KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，琼脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，马铃薯2.仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、实验内容1.分组配制高氏一号培养基300ml。配方：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2

3、O 0.01g 琼脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制马丁氏培养基配方：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂1520g，水1000mL，自然pH。配制方法配制20马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml。80浸泡1h，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20马铃薯浸汁，贮存备用。配制时，按每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续

4、加热融化并补足失水。4.每组制备玻璃珠无菌水(45ml)三角瓶2个。5.每组制备无菌水试管(4.5ml/管)10支。6.每组包9cm培养皿24套，6套为一包。7.每组包1ml吸管5支，玻璃刮铲4个。四、方法步骤（一）培养基的制备与分装1.称量 按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。2.熔化 在沸水浴锅中加热熔化。3.调pH 用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。4.过滤 趁热用多层纱布过滤（本实验勿需过滤）5.分装 将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4

5、，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。（二）无菌水的制备7.用量筒量取45ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。8.用5ml吸管取4.5ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（三）器皿的准备9.培养皿的包装 每6套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。10.吸管的包装 首先

6、在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。11.玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。（四）培养基、无菌水、器皿的灭菌12.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，1.05kg/cm2压力，121.3,20min湿热灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。13.灭菌完毕，将试管培养基冷至50左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。14.将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。15.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。五、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？2.加压蒸汽灭

7、菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？3.干热灭菌应该注意哪些事项？4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么？六、实验报告实验二、微生物的分离、接种及培养法一、目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离方法有：1)平板划线分离法；2）稀释平板分离法。在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的

8、质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作。三、实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。 四、实验内容与步骤（一）微生物的分离

9、技术1.平板划线分离法 借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到 分离的目的。具体方法如下：倒制平板制备含菌样品稀释液划线倒置适温培养观察记录1)倒制平板：将固体培养基熔化冷却至50-55注入培养皿内15ml（无菌操作）旋匀静置凝固即成平板在皿盖边贴标。2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37，培养24-48小时，观察

10、平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录2.稀释平板分离法：采用稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种计数方法。1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品10g，加入装有90ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成 10-1土壤稀释液，然后在酒精灯火焰旁，用无 菌移液管吸取1ml10-1的稀释液注入9ml无菌水的试管内，制成10-2的稀释液。用同样方法再制成10-3，10-4，10-5，10-6的稀释液。稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的10

11、-6的稀释液开始吸取1ml的10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml的10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内。注意：每稀释一个浓度，必须更换一支无菌吸管。用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10 -4稀释度。2)平板的制作：将固体培养基融化，待冷却至45-50左右，分别倾入已盛有10-4、10-5、10-

12、6稀释液的无菌培养皿内，轻轻摇匀，静置凝固。凝固后将平板倒置于37恒温箱中，培养24-48小时，细菌即在所固定的位置长成肉眼能见的菌落。（二）微生物的接种方法将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的接种方法如下：1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，灭菌后，接种。此法用于好气性微生物的接种。2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。在将接种环送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇

13、动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保 存之用。

14、注意事项不同种类的微生物，其培养温度、培养时间有所不同。五、实验报告1观察划线分离的菌落形态。2采用菌落计数法，计算出所检土壤样品的细菌总数（活菌数）。3稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？实验三、水中细菌总数和大肠菌群的检测（一)实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。（二）实验原理水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群

15、和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每ml不超过100个。所谓细菌总数是指1ml或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(ml)。它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在3724h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称

16、，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100ml水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于

17、自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。(三)实验器材(1)菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。(2)大肠菌群的测定；1)培养基：乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25ml，水1000ml，pH7.4。制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50ml或每管5ml，并倒置放入一个杜氏小管，l15灭菌15min。伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04

18、2g，2伊红水溶液20ml，0.65美蓝水溶液l0ml，琼脂17g，水1000ml，pH7.1。制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装121灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。乳糖发酵管：除不加胆盐外其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。（四）实验方法(1)水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先

19、将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。(2)细菌总数的测定：1)水样稀释及培养：按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释。根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。将熔化后保温度45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15ml

20、，并趁热转动平皿混合均匀。待琼脂凝固后，将平皿倒置于37培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。2)计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。3)计数的报告：平板菌落数的选择：选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板

21、后乘2以代表整个平板的菌落数。稀释度的选择：a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。b若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。c若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。d若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在

22、30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。细菌总数的报告：细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：表1 稀释度的选择及细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/（cfu/g或cfu/ml）报告方式（菌落总数）/（cfu/ml或cfu/g）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.6×1042多不可计295461.

23、63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313-313000310000或3.1×105527115-270270或6000-10107多不可计30512-3050031000或3.1×1041)生活饮用水或食品生产用水的检验：初步发酵试验：在2个各装有50ml的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100ml。在10支装有5ml的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10ml。如果饮用水的大

24、肠菌群数变异不大，也可以接种3份100ml水样。摇匀后，37培养24h。平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37培养1824h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落13个，37培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2

25、（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。2)水源水的检验：用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。严重污染水：1，01，001000lml各1份。中度污染水：101，01，001ml各1份。轻度污染水：100，10，1，01mll各l份。大肠菌群变异不大的水源水：10ml各l0份。表2 大肠菌群检索表（饮用水）012备注每升水样中大肠菌群数03411接种水样总量300ml（100 ml2份，10 ml10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表3 大肠菌群数

26、变异不大的饮用水阳性管数0123接种水样总量300ml（3份100 ml）每升水样中大肠菌群数341118表4 大肠菌群检索表（严重污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001-900接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001ml各一份）-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+238000表5大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01-90接种水样总量

27、为11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230-+280+-+920+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大肠菌群检索表（轻度污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1001010.1-9接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1ml各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7 大肠菌群变异不大的水源水阳性管数012345678910每

28、升水样中大肠菌群数10112236516992120160230230备注接种水样总量100mL(10ml10份)操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1ml及1ml以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1ml以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表4、表5、表6或表7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。附：滤膜法滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升

29、水样中含有的大肠菌群数(MPN)。(1)准备工作：1)滤膜灭菌：将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。2)滤器灭菌：准备容量为500ml的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121高压灭菌20min。3)培养：将品红亚硫酸钠培养基放入37培养箱内预温30-60min。(2)过滤水样：1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333ml注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在50kPa压力下进行抽滤。2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤

30、器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37培养箱内培养16-18h。(3)结果判定：1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的菌落。淡红色，中心颜色较深的菌落。2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，

31、一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是"时间就是生命"。近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了突破性进展，许多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。一、微量多项试验鉴定系统该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.

32、1ml）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养248小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站

33、的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异较大，有的

34、价格贵，有的个别反应不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。图1 API 20E鉴定卡示意图鉴定未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表（表1），判定各项反应是

35、阳性还是阴性反应；按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记""，则写下其所定的数值，反应阴性者记""，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。表1 API20E反应判定表鉴定卡上的反应项目反 应 结 果 代 号项 目 名 称阴 性阳 性ONPN-半乳糖苷酶无色黄ADH精氨酸水解黄绿红，橘红L

36、DC赖氨酸脱羧黄绿红，橘红ODC鸟氨酸脱羧黄绿红，橘红CIT枸椽酸盐利用黄绿绿蓝H2S产H2S无色黑色沉淀URE尿素酶黄红紫TDA色胺酸脱氨酶黄红紫IND吲哚形成黄绿红VPV.P.试验无色红GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖产酸蓝黄绿MAN甘露醇产酸蓝黄绿INO肌醇产酸蓝黄绿SOR山梨醇产酸蓝黄绿RHA鼠李糖产酸蓝黄绿SAC蔗糖产酸蓝黄绿MEL密二糖产酸蓝黄绿AMY淀粉产酸蓝黄绿 ARA阿拉伯糖产酸蓝黄绿表2 API20E举例说明项目名称ONPGADHLDCODCCITH 2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARA所定数值124124124124124

37、12412试验结果+-+-+-+记下数值10412000010412412412编 码5305773检索结果5305773 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）另一种应用广泛的是Enterotube系统，可以称为肠道管系统。它的鉴定卡是由带有12个分隔室的一根塑料管组成，每个分隔室内装有不同的培养基琼脂斜面，能检验微生物的15种生理生化反应，一根接种丝穿过全部分隔室的各种培养基，并在塑料管的两端突出，被两个塑料帽盖着，像一根火腿肠，如图2所示。图2 Enterotube系统示意图 鉴定未知菌时，将塑料管的两端帽子移去，用接种丝一端的突出尖端接触平板上待鉴定的菌落中心，然后

38、在另一端拉出接种丝，通过全部分隔室，使所有培养基都被接种，再将一段接种丝插回到4个分隔室的培养基中，以保持其还原或厌氧条件。图3示意肠道管系统的接种过程。培养后，有的分隔室也需加试剂。然后按API20E类似的步骤，观察反应变色情况，判定试验结果阴性或阳性，写出编码数，形成5位数的编码，因12个分隔中有3个分隔中的培养基都能观察到2种生化反应，此肠道管系统共15个反应，可分为5个组。根据编码查肠道管系统的索引，或用计算机检索，获得鉴定细菌的种名或生物型。图3 Enterotube系统的接种过程有一种可携带的检测水中大肠菌数的大肠菌测试卡，即微孔（Milliporo）滤膜菌落计数板（图4）。它是在

39、一块拇指大小的塑料板上，装有一薄层脱水干燥的大肠菌选择鉴定培养基，其上覆盖微孔滤膜(0.45m)，整个塑料板有一外套。检测时，脱下外套，将塑料板浸入受检水中约半分钟，滤膜仅允许1毫升水进入有培养基的一边，干燥的培养基则吸水溶解，扩散与滤膜相连，而1毫升水中的大肠菌则滞留在膜的另一边，再将外套套上，培养12-24小时，统计滤膜上形成的兰或绿色菌落数。菌落的多少可以表明水中污染大肠菌群的状况。该测定卡携带和培养都方便，适于野外工作和家庭使用，因可以放在人体内衣口袋中培养。置换塑料板上的培养基，可以制成检测各种样品的微孔滤膜块。图4 大肠菌测试卡示意图国际上常用的6种微量多项试验鉴定系统的优、缺点比

40、较，见表3。表3 6个鉴定系统的优、缺点比较特 点EnterotubeR/BAPI20EMinitekPathoTecMicroID准确性(和常规法比较)95%9098%9398%91100%95%95+%诊检时间(小时)182418241824182444最后报告时间(小时)4848484824302430系统的简单性简单简单不简单较简单不简单较简单底物载体培养基培养基脱水培养基圆纸片纸条圆纸片试验项目数15142014(35)1215 选择性良好良好良好很好一般良好不够稳定的项目柠、尿乳、葡/气 DNaseH2S、赖、鸟、柠H2S尿、七赖、山、肌实验五、抗微生物药物敏感性试验一、实验目的抗

41、微生物药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。纸片扩散法二、实验原理此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏试验方法。将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓

42、度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。三、实验器材和试剂1菌种 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床分离的菌株。2培养基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。3试剂 无菌生理盐水，0.5麦氏标准比浊管（McFarland standard，相当于1.5×108CFU/ml），抗菌药物纸片：选用直径6.35mm吸水量20l的专用药敏纸片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨苄西林

43、（AMP）、哌拉西林（PIP）、头孢唑啉（FZN）、头孢呋辛（FRX）、头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、复方新诺明（SXT）。4其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。四、方法步骤1菌液制备（1）对数生长法：从琼脂平板上选取至少3-5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含45ml的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35孵育2-6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。（2）直接菌落法：从孵育18-24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无

44、菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。2接种 细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。3贴药敏纸片 涂布后的平板在室温下干燥3-5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。4孵育将平板倒置放入35孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中），16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。五、结果判断抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据

45、CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药。敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一个“缓冲区”，用以防止因微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。六、药敏试验结果判断注意事项（1）药敏试验的结果容易受培养基、抗菌药物、孵育条件等多种因素影响，实验室开展药敏试验时应定期用标准菌株对上述因素进行质量控制。（2）变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样

46、爬行生长可以忽略。（3）对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，所以抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部分（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。（4）对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。（5）沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性。（6）肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性）、磺胺甲 唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，

47、但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感。对抑菌环大小的解释标准七、影响药敏结果的因素1.培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。2.细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。3.药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。4.培养时间：一般培养温度和时

48、间为37 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。八、思考题1.操作药敏试验并说出注意事项。2.试述药敏试验的意义？3.如何根据药敏试验的结果选择药物？4.什么叫抑菌圈？如何根据抑菌圈大小判断细菌对药物的敏感度？九、实验报告附：干燥抗菌纸片的制备取直径6mm的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液中，一般每毫升抗菌药液中，装滤纸片100片，浸泡12h后，37干燥或真空干燥，密封冷藏备用。实验六、微生物的生理生化反应微生物生理生化反应的多样性在自然界产生了两种结果:

49、第一是使自然界的有机分子都有可能得到分解;第二是使不同微生物之间有了互相作用和互相依赖的基础.例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物,或者一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物.所以微生物的生理生化反应也被作为细菌鉴定和分类的内容。一、大分子物质的水解试验(一)目的要求1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。(二)基本原理微生物对大分子的淀粉,蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至

50、细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等.这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实:淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定不再产生蓝色,表明细菌产生淀粉酶.脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH,使pH降低,加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色,说明胞外存在着脂肪酶。微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外,当缺乏糖类物质时,亦可用它们作为碳源和能源.明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质,在25以下可维持凝胶状态,以固体形式存在.而在25以上明胶就会液化.有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞

51、外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,甚至在4仍能保持液化状态。还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶来检测.石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成,是昏浊的蓝色.酪素水解成氨基酸和肽后,培养基就会变得透明.石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵,因为在酸存在下,石蕊会转变为粉红色,而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解会引起碱性反应,使石蕊变为紫色.此外,某些细菌能还原石蕊,使试管底部变为白色。尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物.尿素酶能分解尿素释放出氨,这是一个分辨细菌很有用的诊断实验.尽管许多微生物都可以产生尿素酶,但它们利用尿素的速度比变形杆菌属(P

52、roteus)的细菌要慢,因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员.尿素琼脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚红.酚红在pH6.8时为黄色,而在培养过程中,产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨,使培养基的pH升高,在pH升至8.4时,指示剂就转变为深粉红色。(三)器材1.菌种 枯草芽胞杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),普通变形杆菌。2.培养基 固体油脂培养基,固体淀粉培养基,明胶培养基试管,石蕊牛奶试管,尿素琼脂试管。3.溶液或试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugol's iodine solution)。

53、4.仪器或其他用具 无菌平板,无菌试管,接种环,接种针,试管架。(四)操作步骤l.淀粉水解试验(1)将固体淀粉培养基溶化后冷却至50左右,无菌操作制成平板。(2)用记号笔在平板底部划成四部分。(3)将枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种,在平板的反面分别在四部分写上菌名。(4)将平板倒置在37温箱中培养24h。(5)观察各种细菌的生长情况,将平板打开盖子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉己被水解,为阳性.透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。2.油脂水解试验(1)将溶化的固体油脂培养基冷却至50左右时