淀粉酶产生菌的筛选

1、实验一淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛树权生命科学学院 08 级生物技术（三）班 豆豆同组人： xx xxx摘要 ：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。 利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用 淀粉培养基培养， 最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。 再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。 关键词 ： 淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计一、实验目的 ：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2 、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解

2、分光光度计法测定酶活力的原理及方法。二、实验原理 ：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适 宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成 菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀 粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生 存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被 分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌 种产淀粉的能力。淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括a -淀粉酶和B-淀粉酶等，a -淀粉酶可从淀粉分子内部

3、切断淀粉的a -1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘 度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉 长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根 据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定a -淀粉酶的活力。三、实验器材及试剂：1. 、材料：长春师范学院家属楼前小菜园2培养基：(1) 分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏 3g、蛋白胨10g、 NaCI 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2 , 121C

4、 灭菌15min,待冷却至50C左右时，于超净工作台倒平板)(2) 筛选培养基：淀粉培养基(可溶性淀粉 20g,硝酸钾1g,磷酸氢 二钾0.5g, 氯化钠0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g, 水1000毫升，调整pH值到7.27.4。)(3) 摇瓶培养：淀粉培养液。3、试剂：碘液、2河溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。4、器材:培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。四、实验步骤 ：1、淀粉产生菌的筛选：（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉

5、培养基，倒平板备用； （ 3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一天；（4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在 37 摄氏度培养 箱中培养两天；（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。2、酶活力测定：（ 1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml 无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中， 30 摄氏度摇瓶培养 72h。（2）酶液稀释：取发酵液进行4000r/min离心5min,取上清液，用缓冲液适当稀释。（3）标准曲线制作：准备七支试管,按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管 溶液在660nm下的ODf直。然后以淀粉

6、浓度为横坐标，吸光度为纵坐标， 做标准曲线。（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗 的淀粉量管号1234567 （样品）淀粉稀释液/ml2(0%)2(0.2%)2(0.5%)2(1.0%)2(1.5%)2(2.0%)2(2.0%)缓冲液/ml111 111140摄氏度水浴保温5min蒸馏水/ml111 1110粗酶液/ml000 000140摄氏度水浴保温30min,然后放入沸水浴5min稀碘液/ml111 1111（5）酶活力测定：酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所分解的淀 粉毫克

7、数来衡量。五、实验结果：1淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌透明圈的检验图(2)标准曲线:培养基中含有淀粉，淀粉产生菌具 有产生淀粉酶的能力，淀粉酶能将 培养基中的淀粉分解掉。 当在培养 基上滴加稀碘液时，含有淀粉的部 分被染为蓝色，而被淀粉酶消耗掉 淀粉的部分则表现为不着色的透 明圈。根据透明圈的大小可粗估出 不同淀粉产生菌的产淀粉酶能力 大小，透明圈越大则产淀粉酶能力 越强。2、酶活力测定:(1)实验原始数据:管号1234567OD66000.2350.5841.1071.3751.7881.540(3) 计算：样品的 OD660=1.540查标准曲线可得：淀粉含量 =1.540/0.047=3

8、2.766mg 初始淀粉含量=2g/100mlx 2ml=0.04g=40mg被消耗的淀粉含量=40mg 32.766mg=7.234mg酶活力=7.234mg/(1mlx 0.5h)=14.468 mg/(ml h)六、实验结果分析 ：平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响 , 例如菌种特性、接种量 大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等。绘制的淀粉含 量标准曲线也会受实验室环境影响及误差而造成不准确，酶活力的表示 方法也有多种，仅是一个相对的数值。七、参考文献：1 吴根福、杨志坚 . 发酵工程实验指导 . 北京：高等教育出版社， 2006.2 王弋博 , 李博, 李三相 , 张海林 , 金文晶 . 异淀粉酶产生菌的分离纯 化及生长特性 . 青海师范大学学报， 2003.3 王丽丽，仪宏，田庄，李志军 . A2 淀粉酶产生菌的平板筛选法的研 究与改进 . 河北轻化工学院学报， 1998.4 李艳 . 发酵工程原理与技术 . 北京：高等教育出版社， 2007.5 吴燕萍、金其荣、李迅 . 微生物法生产普鲁兰酶的研究 J . 生物技术 ,1998 ，8(6):14-17.6 唐蕾. 耐热性普鲁兰酶进展 J . 天津微生物 ,1983.7 袁勤生.应用酶学M.上