LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸精氨酸运输体

1、LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸/精氨酸运输体,以此保持体内氨基酸的平衡摘要：从溶酶体运出分解产物的缺陷导致人类溶酶体储积病。发生于胱氨酸运输基因CTNS的突变导致胱氨酸病,但其他溶酶体氨基酸转运蛋白在分子水平上很少有区别。在这里,我们找到了秀丽隐杆线虫的赖氨酸/精氨酸运输蛋白LAAT-1。laat-1的损失造成赖氨酸和精氨酸在大量的有降解缺陷的溶酶体中的积累。在ctns-1的突变体(线虫CTNS的同系物)中,LAAT-1可以减少溶酶体胱氨酸的水平,并且可以通过半胱胺抑制溶酶体变大，半胱胺是一种通过将胱氨酸转化为赖氨酸类似物来缓解溶酶体病的药物。LAAT-1也维持可供胚胎发育期利用的胞质赖氨酸/

2、精氨酸水平。因此,LAAT-1是溶酶体内的赖氨酸/精氨酸转运体,这暗示了半胱胺可以缓解溶酶体储积病的分子解释。从溶酶体运出水解产物的功能缺陷引起溶酶体储积病的发生，如胱氨酸病,其特点由于溶酶体胱氨酸运输体基因CTNS(cystinosin)的突变导致自由的胱氨酸在溶酶体内的积累(1 - 4)。对胱氨酸病最有效的治疗药剂,半胱胺(一种氨基硫醇),它可以将溶酶体内自由的胱氨酸转换为半胱氨酸和混合的半胱氨酸-半胱胺的二硫化物,这被认为是通过赖氨酸/阳离子氨基酸运输体将其从溶酶体以赖氨酸类似物的形式运出的一种方式 (5 - 7)。这种运输体的分子类型仍然未知。尽管有生化检测的方法,但大多数哺乳动物的溶

3、酶体氨基酸转运体仍然没有分子水平的表征(1)。通过对可持续增多的胚胎细胞尸体的秀丽隐杆线虫突变体的一个正向遗传筛查,我们隔离了一个隐性突变体qx42,其内积累了许多具有折光性的尸体状物质和阳性溶酶体示踪物斑点,提示存在异常溶酶体(图S1,A到G)。使用可以标记溶酶体的NUC-1:mCherry (8、9)或溶酶体示踪染色,我们发现qx42溶酶体的体积平均是野生型秀丽隐杆线虫溶酶体体积(1.3*0.5 um³) 的两倍(图1,A到F,和图S1,H 到K)。图1.laat-1突变体积累了增大的溶酶体。(A到F) 在一个laat-1(qx42)胚胎(B)或除野生型(A)和(E)到(E)外的

4、细胞(F)到(F)中通过NUC-1:mCherry(A)和(B),箭头) 或红色溶酶体示踪物(LTR)(E)到(F),箭头的头) 来显示观察增大的溶酶体。在(C)和(D)中溶酶体的体积被量化。不同种系中溶酶体的平均体积(±SEM,n = 100)如(D)所示。* * P < 0.0001。(G和H)在野生型动物皮下(G)或鞘(H)细胞的荧光图像中显示有LAAT-1: GFP和NUC-1: mCherry的表达。在(A),(B)和(G)到(H)中，插图显示的是黄色箭头溶酶体放大4倍的图像。比例尺: (E)和(F)中是2微米; 其他图片中是5微米。我们接着检查qx42突变体是否影响

5、溶酶体的产物降解。凋亡细胞首先被吞噬,然后在溶酶体内降解。细胞死亡和细胞尸体吞食在qx42突变体中是正常的(图S2)。然而, 通过HIS-24:GFP或H2B:GFP (分别标记所有体细胞和胚芽核包括细胞尸体中的染色质)的缺失衡量在吞噬体(通过GFP:RAB-7或NUC-1:mCherry)中凋亡细胞的降解，其在qx42突变体中受到了严重影响,其中的HIS-24:GFP持续大于野生型的4倍(图2A和图S2,L到O)。通过卵黄脂蛋白的降解来滋养生长中的细胞贯穿于整个胚胎发生时期(10、11)。在qx42突变体中, 卵黄标记VIT-2:GFP的肠道分泌和卵母细胞对物质的吸收是正常的(图S3,A到B

6、)。然而,值得注意的是在扩大的斑点中qx42胚胎累积了更多的VIT-2:GFP,这与NUC-1:mCherry重叠,暗示溶酶体对卵黄的降解存在缺陷(图2,B到D,和图S3,C到H)。细胞表面蛋白CAV-1和RME-2在野生型胚胎中是可以内在化和降解的, 而在qx42胚胎中则累积于增大的溶酶体中(图S4)(12)。受损的细胞器和蛋白质聚合物是通过自噬途径递送到溶酶体对其进行降解的(13)。在野生型中胚胎发育期的自噬基质SEPA-1和T12G3.1(哺乳动物p62的线虫同系物)被清除，但在qx42突变体胚胎中将持续到后期，并且与NUC-1:mCherry重叠,这显示自噬溶酶体的降解存在缺陷(图2，

7、E到G和图S5)(14、15)。因此,qx42突变体影响了溶酶体内吞噬、内吞和自噬物质的降解。图2.laat-1突变体在溶酶体降解各种物质方面存在缺陷。(A) 野生型和laat-1(qx42)胚胎在不同的时间点显示HIS-24:GFP和GFP:RAB-7的荧光图像。箭头指示吞噬溶酶体。右边的柱状图显示其量化的结果, 括号中显示的是平均持续时间(±SEM)。(B到G) 野生型(B)和(E)或laat-1(qx42)(C)和(F)胚胎显示NUC-1:mCherry和VIT2:GFP(B)和(C)或T12G3.1:GFP(E)和(F)的共焦荧光图像。箭头表示重叠的GFP和mCherry;箭

8、头的头指示不重叠的GFP。插图显示黄色箭头或箭头的头所指的结构放大4倍的效果。量化结果显示在(D)和(G)中。每个种系中至少选出10个胚胎。数据显示为平均值±SEM。* * P < 0.0001。比例尺：5微米。在qx42中受到影响的基因是Y43H11AL.2,它编码一个内含七个可预测的跨膜域和两个内在的PQ(脯氨酸-谷氨酰胺)循环重复单位的保守蛋白质,这是溶酶体胱氨酸转运蛋白(LCTs) 的特点(16)(图S6F)。Cystinosin，这一原始型LCT的家族成员是溶酶体胱氨酸运输体，其功能异常将导致胱氨酸病(4)。我们基于其与LCT家族蛋白和细胞功能将Y43H11AL.2基

9、因命名为laat-1(溶酶体氨基酸运输体1) (见下文)。在qx42中laat-1上存在一个A > T的突变,从而导致在Asn127之后产生了一个提前终止的密码子。其他独立分离的laat-1等位基因突变也导致增大的溶酶体和持续性细胞死亡的表型(图S1,L到R,和图S2K)。在胚胎、幼体以及成体的各种细胞中均有laat-1的表达 (图S7)。GFP或mCherry与LAAT-1的融合,充分弥补了qx42的缺陷(图S6,A到E), NUC-1-或溶酶体阳性示踪物标记的膜的结构和与溶酶体膜蛋白CTNS-1这一人类cystinosin的秀丽隐杆线虫同系物重叠(17),表明LAAT-1位于溶酶体膜

10、(图1,G到H,和图S7,A到C)。LAAT-1(299 - 304):GFP缺乏C末端溶酶体分选基序(18)，染色的血浆膜代替了溶酶体并且未能获得LAAT-1(qx42)突变体的表型,这表明LAAT-1的功能取决于它的溶酶体的定位(图S6,A到F,和S7，D到E)。我们对从线虫胚胎纯化出的溶酶体进行了检查 (图S8),并且发现CTNS-1的缺失导致胱氨酸积累,这表明CTNS-1就像人类的cystinosin一样介导了胱氨酸从溶酶体的流出 (图3A)。在laat-1突变的溶酶体中,胱氨酸的水平是正常的,但赖氨酸和精氨酸的含量分别比野生型的高16和8倍,表明LAAT-1从溶酶体中运出赖氨酸和精氨

11、酸 (图3A和图S9A)。来自于ctns-1突变体的巨噬细胞状的体腔细胞包含有巨大的颗粒(直径>6.5微米),它们累积内源性的产物Cherry并且可被溶酶体膜蛋白CUP-5标记，而不是胞内蛋白REM-8,这表明他们是增大的溶酶体(19、20)(图3,B和C,和图S9B)。大多数野生型和laat-1(qx42)体腔细胞包含小溶酶体(< 4.5毫米)或大2至3倍的溶酶体(4.5-6.5微米)(图3C)。ctns-1突变体的半胱胺治疗大大降低了溶酶体内胱氨酸的积累并几乎完全抑制了溶酶体增大的表型(图3,C和D)。然而,在laat-1(qx42)和ctns-1(ok813)双突变体中,半胱

12、胺不能耗尽溶酶体的胱氨酸，也不能抑制溶酶体的增大,它积累了高水平的胱氨酸和赖氨酸类似物与半胱氨酸-半胱胺二硫化物的混合物(图3,C到E)。这些数据清楚地表明laat-1将赖氨酸运输出溶酶体。图3.LAAT-1是溶酶体赖氨酸和精氨酸的运输蛋白。(A)在确定野生型中胚胎溶解产物并且将其规定为一个单位的前提下，溶酶体中氨基酸浓度与胞质中氨基酸浓度的比值 (y轴)。(B) 野生型和ctns-1(ok813)coelomoctyes的微分干涉差(DIC)和荧光图像显示分泌的Cherry(ssCherry)和溶酶体的标记物GFP:CUP-5。溶酶体被Cherry和CUP-5标记(箭头)。插图显示的是黄色箭

13、头所指的溶酶体。比例尺：5微米。量化结果显示在(C)中。(D和E)胱氨酸(D)和半胱氨酸-半胱胺混合二硫化物(E)决定于半胱胺治疗后和规范化为1个单位的野生型中溶酶体的纯化分数(PLF)。(F和G) 在(F)LAAT-1 -或(G)PQLC-2-表达的 cos 7细胞中赖氨酸和精氨酸的吸收量。数据显示为平均值±SEM。* * P < 0.0001;* P < 0.05;所有其它点P > 0.05。数据在(A)、(D),(E)、(F)和(G)代表三个独立的实验。我们设计了研究LAAT-1或与其相对应的人类PQLC2运输赖氨酸和精氨酸是否使用基于整个细胞运输体的试验(4

14、)。野生型中PQLC2:GFP定位于COS-7细胞的溶酶体中,而缺乏溶酶体分选基序的PQLC2(LL):GFP则与浆膜结合, 这表明PQLC2是一种像LAAT-1一样的溶酶体膜蛋白 (图S6F和图S9 ，C 到H)。浆膜有针对性的表达LAAT-1LAAT -1(299 - 304):PQLC2 GFP或PQLC2(LL):GFP导致了赖氨酸和精氨酸的吸收增加,当在第一个PQ循环中不变的脯氨酸突变为亮氨酸时，这一现象几乎完全被消除(图3,F和G,和图S6F)。在LAAT-1或PQLC2-表达的细胞中组氨酸吸收量增加,而不是丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、胱氨酸,这表明阳离子氨基酸具有特定的运输(图S1

15、0)。laat-1溶酶体没有明显的组氨酸积累,这表明在体内LAAT-1可能不是主要的组氨酸运输体(图S9A)。laat-1突变体是可以存活的,但是生长缓慢(图4A)。外部补充赖氨酸和精氨酸可以完全缓解生长迟缓的胚胎发育(图4B和图S11,A和B)，但是不能逆转laat-1突变体中增大的溶酶体或有缺陷的卵黄降解表型(图S11C)。因此,laat-1突变体中的缺陷影响赖氨酸和精氨酸运出溶酶体,这限制了其胞质的可用性,从而阻碍了胚胎发育。当氨基酸缺少时,真核细胞通过蛋白激酶GCN2的激活触发氨基酸反应(AAR)途径,导致整体的蛋白质合成受到抑制(21)。与此一致的是,laat-1胚胎也减少了蛋白质的

16、合成,这样就通过补充赖氨酸和精氨酸得到了有效地缓解(图4 C和图S11D)(22)。AAR途径是氨基酸不足时生物体存活所必需的在(23、24)。gcn-2(ok871)胚胎发育正常,但当laat-1有缺陷时则死亡。合成的致死性可以被补充赖氨酸和精氨酸所完全缓解，而不是甘氨酸(图4 D)。因此, laat-1的缺陷限制了胞质赖氨酸和精氨酸的合成, 当gcn 2介导的AAR途径受到影响时就会引起胚胎死亡(图S11E)。图4. LAAT-1维持正常胚胎发育中赖氨酸和精氨酸的可用性。(A和B) 外部补充赖氨酸和精氨酸可以缓解laat-1突变体中的胚胎发育阻滞。至少有88个胚胎被检测。(C) 在野生型,

17、laat-1(qx42)和laat-1(qx111)胚胎中通过荧光光漂白恢复在有或没有外部提供的赖氨酸和精氨酸的情况下测定Plaat-1mCherry来表示蛋白质合成率。在每个种系和治疗后至少有20个胚胎被量化。(D) laat-1和gcn 2的缺陷导致产生胚胎的致死性。y轴表示每个种系和治疗后可存活的胚胎的比例。三个独立的实验里每个至少有95个胚胎被检测。在图(C)和(D)中,数据显示为平均值±SEM。* * P < 0.0001。在图(B)到(D)中,赖氨酸(K)和精氨酸(R) 每种补充100毫摩尔,甘氨酸(G)补充200毫摩尔。我们已经将LAAT-1及其人类的同系物PQLC2确定为溶酶体的赖氨酸/精氨酸运输体。在ctns-1(lf) 单突变体中，半胱胺治疗显著降低了