大创实验初步方案

1、大创实验初步方案 乙醛脱氢酶( ALDH) 是一类依赖于NAD( P) +的酶类，负责催化生物体内各种醛类转化为对应羧酸，该类蛋白质都含谷氨酸、半胱氨酸活性位点，根据蛋白质具体序列差异，生物中至今发现有22 个不同家族，其中植物13 个，不同家族酶类除了乙醛、丙二醛等通用底物以外，还有各自特异性底物，行使多方面的生物学功能。ALDH7 是乙醛脱氢酶家族中一类尤其保守的蛋白质，甚至在动植物之间也有高度的序列同源性，所以又被称为遗蛋白质( Antiquitin) 。人类ALDH7基因研究得比较透彻，确认在赖氨酸降解途径中负责-氨基己二酸半醛( AASA) 的催化，所以该酶又被称为-氨基己二酸半醛脱

2、氢酶。植物中ALDH7 基因表达受到高盐、干旱等渗透胁迫的诱导，源于ALDH7 可以及时清除逆境中产生的有害醛类抵御活性氧( ROS) 的产生。拟南芥、水稻中过量表达自身ALDH7 可以显著提高植株对逆境的耐性，提高抗氧化能力7; 拟南芥、烟草中过量表达大豆ALDH7，也可提高转基因植株的抗氧化胁迫能力，这些研究进一步反映出该基因 巨菌草属于禾本科狼尾草属植物，主要分布在非洲北部地区，1983 年由福建农林大学林占嬉研究员引进中国，经过30 多年的培育，已经成为一种适合我国南方气候土壤环境的草种。巨菌草适宜在25 35 下生长，植株高大，直立丛生，产量高，糖及粗蛋白质含量高，抗逆性较强，既可作

3、培养料栽培食( 药) 用菌，又可用于制作畜禽饲料，还可以用于水土保持、生物燃料、生物材料等领域的研究。巨菌草作为一种高产优质菌草，有很高的利用价值，值得推广，但其生长需要高温和湿润的土壤条件，而我国南方经常出现的不定期干旱不但降低了它的生产效益，同时也限制了它的进一步推广，因此需要对巨菌草的抗旱性进行一些基础性的研究。巨菌草育种及诱导处理1.育种 本实验采用的是巨菌草种子（）。试验于2016年 月 日至 月日在延安大学大学生命科学学院实验室内完成。育种过程为: 共准备40 个规格一致的圆形塑料盆，每盆盛有2 kg 土质一样的土，浇足充足的水份。每盆播撒十到十五颗种子，种植深度约三到四厘米，待全

4、部长出芽后，选出芽长势较一致的21 盆随机分成3 组进行处理。在胁迫处理前每盆每天浇水至土壤保持湿润而土表没有积水。2.干旱诱导在胁迫处理前每盆每天浇水1 L，使土壤保持湿润而土表没有积水。长到2 周后，第7 组巨菌草停止供水由其蒸腾作用开始进行自然干旱，胁迫天数为6 d; 1 d 后，第6 组巨菌草停止供水开始自然干旱，胁迫天数为5 d; 以此类推，直到第2 组巨菌草开始干旱胁迫，以此形成一个干旱胁迫梯度。第1 组巨菌草每天保持原有浇水量不变作为对照，胁迫天数为0 d。每个处理4 盆。2.1 取样方法胁迫完成后取巨菌草幼苗顶端相同叶位的幼叶作为材料，剪碎叶片混匀，称取一定质量冷藏于 80 保

5、存备用。2.2 测定指标及方法土壤含水量的测定采用烘干法，叶片的含水量和相对含水量测定采用饱和称重法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G 250 染色法，游离氨基酸含量的测定采用茚三酮显色法，脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法。每个指标重复测定3 次。3.结果及分析3.1干旱胁迫下土壤含水量的变化 3.2干旱胁迫时间与叶片含水量关系3.3干旱时间与叶片相对含水量关系3.4干旱胁迫时间与可溶性蛋白含量关系3.5干旱胁迫时间与游离氨基酸含量关系3.6干旱胁迫时间与脯氨酸含量关系巨菌草RNA提取由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中

6、要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌

7、以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏RNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水

8、或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。实验步骤 ：（CTAB法）（1）65°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。（2）液氮中研磨23 g新鲜材料。（3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30s，短时放回 65°C水浴中（45 min）。（4）加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，10000 rpm常温离心15 min。（5）将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。（6）将上清转移至一新离心管中，加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1，即加入1/3体积的LiCl，4°C下沉淀过夜（最多16

9、h）。（7）4°C离心1 h(全速)，弃上清，用500 L70%乙醇洗沉淀，然后用500 L100% 乙醇洗沉淀。（8）用500 L SSTE 溶解沉淀，转移至1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。（9）加入2×体积的无水乙醇，在-70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。（10）4°C离心20 min沉淀RNA（全速）。（11）先用400 L70%乙醇洗沉淀，然后用400 L100% 乙醇洗沉淀，吹干后用65 LDEPC水溶解RNA。用Trizol试剂盒提取菌草总RNA效果也良好。电泳检测RNA：（1）配制1.2%的琼

10、脂糖凝胶（20mL）称取琼脂糖0.24 g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55°C，加入甲醛1.96 mL，冷却后倒胶。（2）RNA电泳取去离子甲酰胺10 L，甲醛1.5 L，10× RNA Buffer 2 L，RNA (24 g, <10 L) 混合液，65°C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 L RNA 加样缓冲液和0.5 L EB，上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RN

11、A（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28S rRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。菌草ALDH7基因引物设计问题最严重1 1 花生EST 搜索与拼接 利用NCBI 的tblastn 程序( http: / /blast ncbi nlm nih gov /)，以水稻、拟南芥ALDH7 蛋白质序列( Os09g0440300 与AT1G54100) 作为检索源，检索花生EST 数据库

12、( 截止2013 年5 月有246 733 条) 。下载所有同源性大于60% 的EST 序列，利用SeqMan( DNA Star) 进行拼接，得到较大片段的长序列，对长序列进行ORF 分析( ORF Finder，http: / /www ncbi nlm nih gov /projects /gorf / ) 与保守结构域分析( Conserved Domain Database，http: / /wwwncbi nlm nih gov /Structure /cdd /wrpsb cgi) ，基于该ORF 序列设计全长与表达相关引物。1 2基因全长的获得、蛋白质翻译、序列同源性与进化树分

13、析以总cDNA 为模板，进行基因全长扩增( TaKaRa Primestar) 。PCR 程序为: 98 5 min; 98 10 s，55 10 s，72 2 min 进行35 个循环; 72 10 min。扩增出的cDNA 进行测序确认。利用EditSeq( DNA Star) 对序列进行蛋白质翻译，其他生物ALDH7 蛋白质序列在NCBI 下载。各序列利用Cluster X2 1 进行同源性分析，利用MEGA 5 10 进行进化树分析，设置都采取软件默认参数。1 3RT-PCR扩增目的基因cDNA的合成：逆转录体系的组成：DEPC处理水 8ul10mMdNTPs 2.5ulRandom&

14、#160;primers 0.4ulRNasin  0.5ul总RNA  2.53ug70 5min速置冰水中冷却再加 : 5*逆转录buffer 5ul逆转录酶(M-MLV) 1ul(200U)加水至25ul37 60min90 5min或者用Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒操作得到cDNAPCR反应体系 50ul PCR体系的组成：10× PCRbuffer 5ulMgCl2 3ul(2.0mM)10mMdNTPs 1ulsense primer  1ul(1umol/l)antisense

15、60;primer  1ul(1umol/l)cDNA  1.5ulDEPC处理水 36.7ulTaq 酶 0.8ul(2.4U)总体积 50ul PCR反应条件：98 5min98 10sec55 10sec 72 2min  35 cycles72 10min目的基因与T载体相连1.1将PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离后回收PCR产物切胶回收 (1)、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶计算凝胶重量。100mg凝胶,计100ul体积,尽量缩短暴露UV灯下的时间. (2)、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,600 ul混合均匀

16、后于65°C 加热,直至凝胶完全熔化。 (3)、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B,300 ul,混合均匀;当分离的DNA片段小于400 bp时加入1个凝胶体积的异丙醇。 (4)、吸取3中的混合液转移到DNA制备管置于2 ml 离心管中,12000× g 离心1 min。弃滤液。 (5)、将制备管置回2 ml离心管中加500 ul Buffer W1, 12000× g 离心30 sec,弃滤液。 (6)、将制备管置回2 ml离心管中,加700 ul Buffer W2, 12000× g 离心30 sec,弃滤液。重复一次。

17、 (7)、将制备管置回2 ml离心管中, 12000× g 离心1 min。彻底去除残余的液体。 (8)、将制备管置于1.5 ml离心管中在制备膜中央加25-30 ul 65°C Eluent或去离子水室温静置1 min。 12000× g 离心1 min洗脱DNA。 1.2回收产物与T载体相连 将回收产物与T载体在T4DNA连接酶下4连接过夜 重组子的转化与筛选 1.1将连接好的重组子转入大肠杆菌DH5，感受态细胞制备： 1)挑取-20保存的DH5单菌落接种于3ml的LB液体培养基中，37160r/min培养过夜（此为一级培养）2)将一级培养菌液接2%的量接种于

18、5ml新鲜LB液体培养基中，37，200r/min,培养2.53.0h，使细菌进入对数生长期。（OD600=0.6左右）3)将二级培养产物分装到1.5ml离心管，冰浴30min.4). 4000r/min离心10min,弃上清。5)加750ul0.1mol/l冷CaCL2液悬浮菌体。6)4000r/min，弃上清，加入80ul预冷的CaCL2（0.1mol/l）重悬菌体。7). 制备好的感受态冰浴过夜成直接用于转化或加无菌甘油（1520%）70长期保存1.2通过蓝白班筛选得到阳性克隆：-互补 的原理 载体上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。 蓝白斑筛选的机理 由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外