正交设计实验在丹参提取中的应用

1、正交试验设计在丹参提取中的应用摘要 丹参是一种具有广泛的药理活性和应用价值的常用中药材，丹参化学成分的提取工艺研究较多，本文探讨采用正交试验设计提取丹参酮的优选工艺。目的:探讨正交试验设计在丹参提取工艺中的应用。方法:采用L9(34)正交试验设计，以乙醇浓度、提取时间、提取次数及溶剂用量作为影响为因素，分辨考察丹参中脂溶性和水溶性成分提取情况，脂溶性成分以丹参酮A的含量为指标，水溶性成分以原儿茶醛含量为指标，确定最佳提取条件和影响因素。结果：丹参提取的最佳工艺为8倍量乙醇，提取1次，每次提取1.5h。结论：丹参药材中有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分两大类，综合两类成分作为优选丹参提取工艺指标

2、，比较全面可靠。关键词：正交试验设计；丹参；提取工艺Abstract: Salvia is a broad pharmacological activity and application value commonly used herbs.Objective:To investigate the orthogonal experimental design in Salvia extraction application. Methods: L9(34) orthogonal design to ethanol concentration, extraction time, extracti

3、on times and solvent consumption as the impact of factors distinguish investigated Salvia extract fat-soluble and water-soluble components of the situation, fat-soluble ingredients to the content of tanshinone A as an indicator, water-soluble components to protocatechuic aldehyde content as an indic

4、ator to determine the optimum extraction conditions and influencing factors. Results: The optimum extraction Salvia is 8 times the amount of ethanol extract a times, each extraction 1.5h. Conclusion: The active ingredient in Salvia miltiorrhiza water-soluble components and fat-soluble ingredients in

5、clude two categories, integrated two types of components as a preferred Salvia extraction process indicators, more comprehensive and reliable.目 录引言41 正交试验设计41.1 正交试验设计原理51.2 正交试验设计法中的几个常用名词51.3 正交设计试验方法61.4 正交试验设计的主要用途72.2 实验内容92.2.1 仪器与试药92.2.2 丹参中脂溶性成分的提取及测定92.2.3 丹参中水溶性成分的提取及测定123 结果与讨论14参考文献15致谢

6、16引言 丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）的根及根茎，始载于神农本草经，列为上品，是我国常用传统中药，味苦，性微寒，具有祛瘀止痛，活血通经， 清心除烦之功效。用于月经不调、闭经、痛经、胸腹刺痛、心烦不眠、肝脾肿大及心绞痛1。现代化学研究证明其主要化学成分为脂溶性成分和水溶性成分两大类。目前从丹参中分离得到的脂溶性和水溶性成分有40余种2。其脂溶性成分主要有丹参酮A，丹参酮B，异丹参酮I，隐丹参酮，异隐丹参酮，异丹参酮，羟基丹参酮I等，其中有代表性的成分是丹参酮A，常作为指标性成分。水溶性成分主要有丹参素(丹参酸甲)，丹参酸乙，丹参酸丙，原儿茶醛，丹酚酸A，

7、丹酚酸B，丹酚酸C，丹酚酸D，丹酚酸E等，其中丹参素，丹酚酸B，原儿茶醛是水溶性成分中的主要有效成分。由于丹参具有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量，防止心肌缺血和心肌梗死，加快微循环血流，促进毛细血管网开放，抑制心肌收缩，减少能量消耗，扩张血管，降低胆固醇、血脂，抑制凝血，激活纤溶，稳定红细胞膜，提高缺氧耐受力，增加肝脏血流量，保护肝损伤细胞，抗肝纤维化，抑制中枢神经系统以及消炎抗菌等作用3。因此对丹参中化学成分的提取引起了人们的广泛关注，其提取方法也就显得尤为重要，本文探讨采用正交试验设计提取丹参酮的优选工艺。1 正交试验设计 在科学研究和工业化生产过程中往往有众多因素影响目标产品的生产，需

8、要研究多个因素对产品指标的效应。若采用多因素完全方案，因素的数量为m，因素的水平数都为q，则多因素完全试验方案的次数n=qm，虽然因素完全试验方案可以综合研究各因素的简单效应、主效应和因素间的交互效应，但是从试验次数的计算式显然可以发现，随着因素数量和因素水平的增多，试验的次数将急剧增多，不仅会给研究带来极大的工作量，而且也会浪费大量的原料和时间。因此，我们需要一种不完全且具有代表性的方法来研究多个因素对产品指标的效应。20世纪60年代初，正交试验设计方法应运而生，使研究方案得到很大的优化。20年后，该方法经田口玄一3次优化设计传到中国并得到广泛的运用4。除一些已经成熟的标准外，正交最优化设计

9、无疑是我们的最佳选择。 1.1 正交试验设计原理正交试验设计是以概率论、数理统计和实践经验为基础，利用标准化正交表安排试验方案，并对结果进行计算分析，最终迅速找到优化方案，是一种高效处理多因素优化问题的科学计算方法5。它是采取部分试验来代替全面试验的方法，挑选出有代表性的试验点来进行试验，通过对代表性的试验的结果分析，了解全面试验的情况，以实现工艺的优化。因此，挑选有代表性的试验点成为正交试验的关键。1951年日本统计学家田口玄一根据试验的优化规律提出了正交表5。正交表成为正交试验设计的基本工具，使得正交试验具备了分散性和整齐可比性，不仅可以根据正交表确定出因素的主次效应顺序，而且可应用方差分

10、析对试验数据进行分析，分析出各因素对指标的影响程度，从而找出优化条件或最优组合，实现试验的目的。1.2 正交试验设计法中的几个常用名词 （1）指标 在试验中需要考查的效果的特性值，简称为指标。指标与试验目的是相对应的。例如，试验目的是提高产量，则产量就是试验要考查的指标；如果试验目的是降低成本，则成本就成了试验要考查的指标。总之，试验目的多种多样，而对应的指标也各不相同。指标一般分为定量指标和定性指标，正交试验需要通过量化指标以提高可比性，所以，通常把定性指标通过评分定级等方法转化为定量指标。（2）因素 因素也称因子，是试验中考查对试验指标可能有影响的原因或要素， 它是试验当中重点要考查的内容

11、。通常用大写英文字母A、B、C等来表示。一个字母表示一个因素，因素又分为可控因素和不可控因素。可控因素指在现有科学技术条件下，能人为控制调节的因素；不可控因素指在现有科学技术条件下，暂时还无法控制和调节的因素。正交试验中，首先要选择可控因素列入到试验当中，而对不可控因素，要尽量保持一致，即在每个方案中，要对试验指标可能有影响的不可控因素，尽量要保持相同状态。这样，在进行试验结果数据的处理过程中，就可以忽略不可控因素对试验造成的影响。（3）水平 试验中选定的因素所处的状态和条件称为水平或位级。例如：加热温度为70、80、90这3个状态，可分别用“1”、“2”、“3”来表示。又如1个因素分为2个水

12、平，用“1”和“2”来表示。同理，一个因素也可分为4水平、5水平或更多水平，以此类推6。1.3 正交设计试验方法正交试验设计的方法很多，但是设计的原理都是根据正交表进行设计的，因此，正交表的合理选用成为正交设计的基础。正交表将各试验因素、各水平间的组合均匀搭配，合理安排，将试验因素各水平平均分布，实现了因素和水平的均匀分散性和整齐可比性，极大地减少了试验次数，并且试验结果能够提供较多的信息，可谓是一种因素、多水平、高效、经济的试验方法。正交表有两种：同水平正交表和混合水平正交表5。同水平正交表是指各因素的水平数相等的正交表，目前有二、三、四、五、七、八、九水平正交表，这种正交表不仅可以使每个因

13、素的不同水平在每一列中出现的次数相等，而且可以安排部分因素之间的交互作用考察。混合水平正交表是指各因素的水平数不完全相等的正交表，这种正交表可以安排水平数不同的多因素试验，使用方便，但有时不便考察因素之间的交互作用。正交表的代号表示成Ln(qm)，其中，L表示正交表，n表示试验次数，q表示因素水平数，m表示因素个数，在正交表中表示其列数。在选择正交表时，首先根据因素水平数和因素的个数确定使用正交表的类型，其中因素水平数应该与正交表中的q值完全相等。因素的个数只要满足不大于m值即可选用该正交表。混合水平正交表表示为Ln(p×qm)，表示试验总次数为玎的正交表中可以安排一个p水平和最多m

14、个q水平的因素。另外，正交表中的行和列发生变化时，试验的方案和正交表的几何结构并无本质变化，因此值得注意的是代号相同的正交表并不唯一，但是代号相同的正交表是等价的。试验设计过程中，可以根据因素的数量和水平数灵活多变、合理地选择正交表并安排试验。 1.4 正交试验设计的主要用途第二次世界大战后，正交试验设计作为质量管理技术之一，受到各国的高度重视。据统计，在正交法推广的头10年，试验项目超过100万项，其中三分之一的项目效果显著，获得极大的经济效益。我国从20世纪50年代开始，以中国科学院数学研究所的研究人员为基础深入研究正交试验设计这门科学，并逐步应用到工农业生产中去，其后正交试验设计得到了广

15、泛研究，尤以上海、江苏等地的推广成绩显著7。正交法之所以受到人们的关注，是因为在工农业生产和科学研究过程中，科学试验是必由之路，而采用正交法安排试验方案可以解决以下问题：一是可以节省大量人力、物力、财力和时间。二是能够明确影响试验指标各因素的主次顺序，即了解哪些因素重要，哪些因素次要。三是可以迅速找到优化方案，在产品开发设计中，迅速找到优化方案，可以大大缩短产品开发设计周期；在生产过程中很快找到优化方案，可以尽快使生产工艺按最佳工艺条件运行，早日实现高效益。四是通过试验结果分析，可以进一步指明试验的方向，克服盲目性等等。 2 利用正交设计试验优选丹参的提取工艺 丹参中脂溶性成分目前均以丹参酮A

16、为有效成分参考指标，水溶性成分以原儿茶醛为有效成分参考指标。目前，丹参中化学成分的提取方法主要有：传统水煎煮法、水提醇沉法、超声波提取法、冻融法、超临界萃取法等8。(1)传统水煎煮法 采用12倍量水，煎煮2次，每次l.5h的煎煮方法，提取后其水溶性成份丹参素和原儿茶醛含量较高，脂溶性成份丹参酮A含量较低，有实验表明，采用水提法，主要提出丹参的水溶性成分，脂溶性的有效成分丹参酮A，仅提出2.6%。(2)水提醇沉法 95%乙醇-50%乙醇-水提取法：准确称取丹参50.00 g，用12倍量95乙醇回流提取1.5h，药渣用12倍量50%乙醇回流提取1.5h，药渣再用12倍量水煎煮1.5h，药液水浴浓缩

17、。水-95%乙醇提取法：准确称取丹参50.00 g，先用12倍量水煎煮1.5h，再用12倍量95%乙醇回流提取，药液回收乙醇，水浴浓缩。95%乙醇-水提取法：准确称取丹参50.00g，用12倍量95乙醇回流1.5h，再用12倍量水煎煮l.5h，药液回收乙醇，水浴浓缩。(3)超声波提取法称取200g丹参药材粗粉，加400mL乙醇，浸泡4h后，超声处理0.5h，过滤。再重复提取2次，乙醇200mL次，合并3次提取液，减压浓缩。(4)冻融法由于冻融法具有提高脂质体对药物的包封率和增加脂质体稳定性等优点，已越来越引起人们的重视。(5)超临界萃取法将丹参粉碎成粗颗粒，称取置于超临界萃取装置中进行提取。含

18、量测定结果表明：用超临界技术提取丹参酮A优于醇提法。因其生产周期短，又无需加热，因此避免了丹参酮A的降解反应，故其能保留较多的丹参酮A。但其设备价格昂贵，生产成本高。(6)其他近十几年来，国内外不少学者将微波应用于天然产物的浸取过程中，有效的提高了收率。利用微波强化固液浸取过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术。 2.2 实验内容 2.2.1 仪器与试药 (1)仪器 紫外检测仪；高压液相泵；液相工作站(2)丹参(栽培四倍体)；丹参酮A、原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇(色谱纯)；其它试剂均为分析纯。 2.2.2 丹参中脂溶性成分的提取及测定丹参脂溶性成分以丹参酮A的含量为指标，

19、 考察不同乙醇浓度、提取时间、提取次数及溶剂用量对提取的影响。正交试验设计因素水平见表1。表1 丹参脂溶性成分提取因素水平表(4因素3水平)因素水平A 醇浓度(%)B提取次数(次)C提取时间(h)D溶剂用量(倍)19511628021.583703210(1)直观分析法取丹参药材粉末约10g按表1进行回流提取，过滤，合并提取液，蒸干；用甲醇溶解，移入25mL的容量瓶中，超声，定容，过滤；取续滤液10L放进液相色谱仪测定含量，用外标法以峰面积计算丹参酮A的含量，如表2。表2 正交试验提取丹参脂溶性成分及结果序号ABCD丹参酮A含量(%)111110.17212220.18313330.17421

20、230.27522310.32623120.46731320.71832130.51933210.36K10.521.151.140.85K21.051.010.811.35K31.580.991.200.95k10.170.380.380.28k20.350.340.270.45k30.530.330.400.32极差R0.360.050.130.17绘制因素、水平和指标之间的关系图，如图1。图1 因素趋势正交试验结果表明: 醇浓度对丹参酮A的溶出指标有显著的影响， 其次是溶剂用量， 提取时间和提取次数对指标影响较小， 即各因素对测定结果的影响次序是ADCB， 考虑到生产实际， 优选工艺为A

21、3D2C3B1， 即用8倍量的70%乙醇，提取1次，每次提取2 h。(1)方差分析法 前面的直观分析法简单、直观、计算量小。但是，直观分析不能给出误差大小的估计。因此，也就不能知道结果的精度。方差分析可以弥补直观分析的不足之处。表3为正交设计方差分析值，表4为方差分析表。表3 正交设计方差分析序号ABCD丹参酮A量(%)111110.17212220.18313330.17421230.27522310.32623120.46731320.71832130.51933210.360.521.151.140.851.051.010.811.351.580.991.200.95m10.170.38

22、0.380.28m20.350.340.270.45m30.530.330.400.32T1-0.180.030.03-0.07T20-0.01-0.080.10T30.18-0.020.05-0.0320.27041.32251.29960.722521.10251.02010.65611.822522.49640.98011.44000.90250.18730.00510.02940.0467T=3.15表4 方差分析表方差来源方差S自由度fS/fF值 显著性A0.187320.0936536.7*B0.005120.002551.0C0.029420.014705.8D0.046720.

23、023359.2E(误差)0.005120.00255方差分析结果表明醇浓度对丹参脂溶性成分提取有显著影响，而提取次数影响不大，由此确定其最佳提取工艺为A3D2C3B1 。与直观分析所得结果一样。2.2.3 丹参中水溶性成分的提取及测定丹参中水溶性成分以原儿茶醛含量为指标，仍然考察乙醇浓度、提取时间、提取次数及溶剂用量对提取的影响。正交试验设计因素水平见表1。(1)直观分析法 称取丹参粉末约115 g，以表5方法进行提取，滤过，蒸干；用甲醇移入25mL 容量瓶中，超声溶解，过滤；取续滤液10L放入液相色谱仪测定含量，用外标法以峰面积计算原儿茶醛含量，提取方法及结果见表5。表5正交试验提取丹参水

24、溶性成分及结果序号ABCD原儿茶醛含量(%)111110.160212220.090313330.091421230.0297522310.0419623120.0532731320.0355832130.0437933210.0437K10.3410.2250.2570.246K20.1250.1760.1760.179K30.1230.1680.1560.164k10.1140.0750.0860.082k20.0420.0590.0590.060k30.0410.0630.0520.055极差R0.0730.0160.0340.027绘制因素、水平和指标之间的关系图，如图2。图2 因素趋

25、势图正交试验结果表明: 醇浓度对原儿茶醛的溶出指标有显著的影响，其次是提取时间，溶剂用量。提取次数对原儿茶醛的溶出影响较小，即各因素对测定结果的影响次序是ACDB， 考虑到生产实际， 优选工艺为A1C1D1B1，即6倍量95%乙醇，提取1次，每次1小时。(2)方差分析法跟前面丹参脂溶性成分提取的方差分析一样，先列出正交设计方差分析表，如表6和表7。表6 正交设计方差分析序号ABCD原儿茶醛含(%)111110.160212220.090313330.091421230.0297522310.0419623120.0532731320.0355832130.0437933210.04370.34

26、10.22520.2570.2460.1250.17560.1760.1790.1230.18790.1560.164m10.1140.0750.0860.082m20.0420.0590.0590.060m30.0410.0630.0520.055T10.0490.0100.0200.016T2-0.024-0.007-0.007-0.006T3-0.025-0.003-0.013-0.01020.11630.05070.06600.060520.01560.03080.03100.032020.01510.03530.02430.02690.01050.00070.00190.0013T=0.5887表7 方差分析表方差来源方差S自由度fF值 显著性A0.010520.0052515*B0.000720.000351.0C0.001920.000952.7D0.001320.000651.9E0.000720.00035方差分析结果表明醇浓度对丹参水溶性成分提取有显著影响，其次是提取时间和溶剂用量，提取次数对实验结果影响不大，由此，确定其最佳提取工艺为A1D1C1B1 。与直观分析所得结果一样。3 结果与讨论丹参药材中有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分两大类，在文献9，10报道中多以脂溶性成分丹参酮A 为指标成分来优选丹参提取工艺，此法值得商榷。在我们的研究中，