慢病毒载体包装构建过程

1、慢病毒载体包装构建过程之巴公共开创作创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细 胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基 因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的 shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的 shRNA的长期、稳定表达。概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病

2、毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要 的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基Md*即3”明叶前曲t翱LF/Mlt pjl口”：d U Qr* SWL7fj>ntrrsrntvir!* urroMwi克 T斯HA因的慢病毒载体在慢病毒包装质专 包装成为有感染力的病毒颗粒，a 外源基因在细胞或活体组织中表昊辅助成分：慢病毒载体辅助成分包 病毒颗粒的细胞系。慢病毒载体包含了包装、转染、寐病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为发生高滴度的病毒颗粒，需要利用表 达载体和包装质粒同时共转

3、染细胞，在细胞中进行病毒的包装， 包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液 后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之 后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。基来源根基理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载 体成分。包装成分：由 HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺 式作用序列而构建，能够反式提供发生病毒颗粒所必须的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达 Env蛋白，其目的也是降低恢复成野 生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞（如人肾293T细胞），即可在细

4、胞上清中收获只有一次性感染能力 而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的 HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及 在此位点拔出的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少 二者的同源性，如将包装成分上5' LTR换成巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子、3' LTR换成SV40 polyA等。实验流程（1和2为并列步调）设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR采取高保真KOCB, 3K内突变率为0%）从模板中（CDN颇粒或者文库）调 取目的基因 CDS区（cod

5、ing sequence ）连入T载体。将 CDS区从 T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3.慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染 293T细胞，转染后 6 h更换为完全培养基，培养 24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒 的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。二、实验资料2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pLVX- IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的 ZsGreen1 表达框能 表达绿色荧光蛋白（GFP 。载体信息1）慢病毒克隆载体图谱如下：2）包装质粒信息如下：PMD2盛体图谱和序列信息PSPAX2t体图谱和序列信息：细胞株293T ,慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DME