抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法

1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、 超氧化物歧化酶（ SOD ）活性测定（ 氮蓝四唑光化还原法 ）1、试剂的配制（ 1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 （PBS，pH7.8）：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4 12H2O （分子量 358.14） 71.7g；B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O （分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS（ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液（Na2HPO4）228.75ml，B 母液（NaH2PO4） 21.25ml，

2、用蒸馏水定容至 1000ml。加入10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术高等教育出版社，2000： 267268。（2） 130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 网上说定容到 100ML 我也不懂。拜托（3） 100 卩 mol/L EDTA-Na 2 溶液：取 0.03721g EDTA - Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml ；（4） 100讪 核黄素溶液：取 0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用 随配，并稀释 10倍（5）750卩mol/L氮蓝四唑（NBT

3、）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加 2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为 SOD 粗提液。提取酶液时如何保存；如果没有测完的需要放在4C的冰箱里。2、酶活性测定2显色反应 取试管（要求透明度好） 5 支， 3 支为样品测定管， 1 支为对照管，另外 1 支作为空白，按表 39-1 加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其它各管于 4000lx 日光灯下反应 20min （要求各管受光情

4、况致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）表39-1 各溶液加入量试 剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.513mmol130mmol/L Met 溶液0.30.375mol10 1 mol750 卩 mol/L NBT 溶液100 卩 mol/L EDTA-Na 2 液0.320卩mol/L核黄素0.32.0 1 mol空白和对照管加缓冲液代替酶液蒸馏水0.050.25酶液总体积3.0加核黄素时记得要快并且要避光，SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知 SOD活性单位以抑制 NB

5、T光化还原的50%为一个酶活性单位表 示。按下式计算SOD活性：（A。 As） VSOD 总活性=A00.5 FW v/mg蛋白表示;式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位 A0照光对照管的消光度值；As样品管的消光度值； Vt样液总体积（ml）;V1测定时样品用量（ml）； FW样重（g）； 蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数（mg/g）。用荧光灯20w照20min可以吗 不可以,二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）:分别取 A 母液（Na2HPO4

6、 ） 61.5ml 和 B 母液（NaH2PO4 ）438.5ml 混匀即为 1000ml PBS（0.2M，pH6.0）；（2）反应混合液配制：取50ml PBS（100mmM，pH6.0），加入28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷 却后加入19ul 30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。( 3)样品测定：称取1g,放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入 100ml 容量瓶 ,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。取试管 3 支，一支取 3ml 反应液并加入磷酸缓冲液 1ml 作调零，两支取 3ml 反应液并 加入 1ml 酶液

7、，立即计时，在 470nm 测定，酶隔 30s 读书一次。测一个样加一个，不要全 部加上。(边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加 好样到开始记时的时间相差不大 )(4)酶活性计算：以每 min OD 值变化(升高) 0.01 为 1 个酶活性单位( u)。POD= ( A470 x Vt / (W Vs >0.01 矽 (u/g min) A47Q为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g); t为反应时间(min) ; Vt为提取酶液总体积； Vs 为测定时取用酶液体积。2、 过氧化氢酶( CAT )活性测定( 1 )试剂配制：Q.2mol/L 磷

8、酸缓冲液(pH7.Q):取 A 母液(W2HPO4) 61.Q ml 和 B 母液(WH2PO4) 39.Q ml 混合后至IQQml。(加IgPVP)(2)反应液配制： 吸取5.68ml 30%的H2O2 (原液)稀释至IQQQml,摇匀即可。(3) 样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织Q.5g置研钵中，加入23ml 4 C下预冷的pH7.Q磷酸缓冲液和少量 石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml容量瓶中，并 用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4C冰箱中静置1Qmin ,取上部澄清液在 4QQQrpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4

9、 C下保存备用 .2.测定：取 1Qml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管( 加入酶液后在沸水中 煮沸 5-1Qmin ， 冷却之后加入 H2O2 测定吸光值 )，按表 4Q-2 顺序加入试剂。表 4Q-2 紫外吸收法测定 H2O2 样品液配置表管号粗酶液 (ml)pH7.8 磷酸 (ml)蒸馏水 (ml)S1Q.21.51.QS2Q.21.51.QS3Q.21.51.Q25 C预热后，逐管加入Q.3ml Q.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石 英比色杯中， 24Qnm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min ，待 3 支管全部

10、测定 完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液( pH=7.8 )3. 结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性（u/g/min）= A24 0X Vt/0. 1 x V1 x t x FW式中 A240 = AS0 （AS1+AS2 ） /2AS0 加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2 样品管吸光值；Vt 粗酶提取液总体积（ml）;V1 测定用粗酶液体积（ml）;FW 样品鲜重（g）;0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）;t 加过氧化氢到最后一次读数时间（ min）五、丙二醛含量的测定1、试剂配制:10%TCA 100g 三氯乙酸

11、 t 1L0.6%TBA 0.6g硫代巴比妥酸，加少量氢氧化钠(1mol/l )溶解 t用 10%TCA定容 100ml (避光）1mol/l氢氧化钠；称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml3、测定步骤：称取剪碎的试材1g,加入2ml 10%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步3.显色反应和测定 溶液，混匀物于沸水浴上反应研磨，匀浆离心（4000r）离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液 2ml （对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm 600nm和450nm波长下的消光度。按公式可直接求得植物样

12、品提取液中MDA勺浓度。MDA勺含量:（2）双组分分光光度法用上述任一方法求得 MDA勺浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA5 mol/g FW )=C2(umol/L)=6.45*(D506000.56*D450C2 为MDA的浓度；D450、=32、D600分别代表450nm 532nm和600nm波长下的消光度值。七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1试剂的配制(1)考马斯亮蓝溶液配制：称取0.001g考马斯亮蓝，溶于 50 ml 90 %乙醇中，加入100 ml85%( W/V )的磷酸(不懂)，85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是 85%的磷酸，加 入100ml就行。再用蒸馏水定容到1 L,贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。(2)100卩g/ml牛血清蛋白(BSA)标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml,再从中吸取 40ml用蒸馏水定容至 100 ml (也可取10mg BSA定容至100ml即为100卩g/ml标准BSA溶液)。2、样品可溶性蛋白含量的测定(1 )样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。吸取样品提取液1.0MI，放入具塞试管中(每个样品设置