米氏常数测定方法

1、酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超 声分散5min,期间准备底物（如TMB或者ABTS）,浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL）, 一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB （外间冰箱上层）溶于 DMSO （二甲亚碉，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS （与TMB放在一起）溶于二次水。3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、2005和10 n移液枪、50人排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前， 开

2、空调定室温（25C,提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量 ±。2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB （或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：200山缓冲液10人催化剂 底物 TMB （ABTS） （0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 人） 32 H 2O2 （排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：2005缓冲液 10人催化剂 H2O2（2, 4, 6, 8, 10, 16, 32, 64 人） 10人底物 TMB （ABTS）

3、（排枪加）数据记录按下表记， Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。Code1234567TimeTMB00.51246810V01Code1234567TimeH2O2246810163264V01、实验,密码为5个1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通）0,按Enter键进入系统。电脑开机，密码为 mby-nano,双击酶标仪软件图标现登录框直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面口同国行塞克燮/普通标志（口项目信息检管面旦博旗u检验”月d长及空白®阴性对照（融r阳性对照（由r标

4、推品（£）成控品镣1测成度长 参考豉长 曝援狗蜜J1怙孑诙城号试剂批号试剂有效期100616002亶旧结晶.i1ZQQ成整5OOOD/OO/OCi券上次曲珊化）Kfjlll | BJ |皆上海科华百进板方式rWn修木4居R即设定饰就陋1 -空MJ B 4 j |d手工眼吉迪1A B cD tF01020304050607OS09101112事熏设11胃E：根度仁，建立，Q日百强很国历1逮出中用他强校监制-11KCB选择“铁动力学”（波长为650nm）株本型呈国目憎且检城程Q行普通标本（D检喷E即铁动力学,W4阕广空白皓阴性对照也； 广用性对照上下 厂标睢品玉费试波长I 650售考浪长

5、12振根解中振根时间西 进板方式1逑坡徽孔披插号试剂批号 试剂有效期 试剂供应商37299 a质控品（Q）旧性公式|=Q. 000标节号苑围意JS标ft控制-EiKfiB堂目!烟IIljjEOLCOLSalBR«BBI，IE3标本类n时间（0闻 4E 43immy昔通标本（L 空白出） 酎物黑皿） 附性对照的 标准品 质控品（ftj蹊目信息检赂盾总F至制槽塔阐目铁动力学:查磁星用测试波长1 65Q 皿微孔版嫡弓试剂批号 试剂有效期!1M61&002_FE-K参考波忙1半板期壶厂中强根时间5. 00 七进梅方式1_连缠JJT曲祝。国剂供应而T长磷质中标本号范田M*1旧性公式Xa

6、 QOO手工损含OP01020304的0607as09101112ABBEBEBBEBEEBBB171319253137434955BcB2B1420汨3238445056BDB391521273339455157BEB4101622293440姐52SSEFB51117232935414753gBuBEi12IB24so36铝435%soBflE£EBBBBEBBEB若底物为 ABTS则检验项目选择?薛标惊呼物-riHffH呼目像校弦项目Z?DD/pl/t）l 我，*sj嚣慧M性性 定定定智阻标本cn 空白阻性对照00 汨性对¥化标他品质姓品15FQTRYIss07112

7、2t>T年1】月歌日ITT知胞喏性THT肿鹿耳死因子FE-J铁动力学CYQ焦白质辕趣时间（波长为 405nm ）二日稔a1。616002_1处上次蜘用）gg设尼施31手工抵台由102090405oe09031"11124rv,BEEEEE：BEBBBBE1T131925313T434955BCE214202632羽切50&6B口E3g15£127第3g*5SiS7EE410IS22233<40*6525EBR5Ll17羽羽3541175359B心E61219243036424B54的1EEBE目EBEBEBE事，事营（T）J»EU®

8、5）陞立演R并为屈后）说也姑新建一个word文档，以日期命名，打开。2、加样：96孔板从左至右编号为 1-12,自上而下编号为 A-H。以TMB为例，从第1 列加样：从A1至H1,每孔加2005NaAc/HAc Buf ;从A1至H1,每孔加10比催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；从A1至H1,每孔分别加不同体积（0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10人）TMB （每加一 个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；用排枪吸取32人H2O2加入A1至H1 ,快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板 时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09: 00: 0

9、0）Code1234567Time00:0000: 3001: 0001: 3002:0002:3003: 0003: 30TMB00.51246810V01用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取 H2O2的量不足。亦可先 将96孔板放入酶标仪，再加 H2O2,这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果 入库”一一 > “是”一一 > “确定”，按下“ PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档， ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存， 可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。（现已

10、可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法 ）3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、 四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到 U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和 电脑。4、若当天不再继续实验，将 24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水 冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。三、数据处理1、打开Origin6.1，点击右上角的"Add New Column "（箭头所指）J i i XT f 9句口 31醍恻日E亦可右击> Add New Column修

11、 Qi钓 £1 - UMTHl F门Fife Edn View PkS tohipn Amtpis Tnds Fwnwt Whdo# Hirp口 |圄|冏1|同同国臼圃看画同日I制制型国剧 A百里回 J < I - |»| 闾叫I三IB1JUJ叵、1*1北1 丁|川|川|制2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位 s, 8个丫列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180S, 0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所 读数据输入。点击“fileSave Project As”保存文件名为“第一组”?3、数据输入完成后，选择 X和丫歹U

12、,点击左下角的“点图”标志（箭头所指）Edit View PiE Cdimi Mdph Tnds Fwnwt 片而加的 He力雨列电、电局.回川 tf g|a|H|ei餐餐 曲.ms.晶.jm.ffl 里 囱例型 湎画朝：.人|二|三国|而拓旧11同丁1产1川川修141：田，I麻,色曳鱼兄;；LJ RjlderlName | Type | View | Sim- | MndiHfed | Qrotad闻&>1 wok Hni 香如zai(wiiiusmw 白 口Grap Norm_ 7KB 前脑即11 H_ 2O1IW作出点图点 击 Analysis >Fit Linear

13、 作口 工批也 111ryrw#i_Rphi |Se鲂 Te，rprmt_Wthat_iHlpJ£ 17ptwHirg FT Fdoef口皿酰ST4d Irjnsbli-州MuMpjt Cirw bltrpolM»l>lMTdpa4aA»._ fFT_fit地网修出 口KJ.Rt回HIM电I &炉HhRi知胸口FH, Liin'LDan M MyK-pwLi jydn-imir Own Pfc., CbtaY19押gt ,虫dpc”曲3的2工31注即内上.50«12»17.丸LftllV rTHT这在结果对话框里，拟合的方

14、程为Y=A+B*X , B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度UJ "| "I I rI I BdM I LBAII I F I N | I I - X T| ,| T | | "| |同样方法得出不同 TMB体积对应的反应初速度 V,记录数据:Code1234567Time00:0000: 3001:0001 :3002:0002: 3003: 0003: 30TMB00.51246810V0100.007140.00902 0.011620.01425 0.015970.015470.017同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V,记录数据。4、新建New Pr

15、oject,数据表1中命名X列为底物（TMB ）浓度，列中数据为 A-H对应的 孔中TMB的物质的量浓度（一般用pmoL/L）;挑选三组比较好的初速度 V,输入Y列选中初速度 V的三列，右击一Statistics on Rows垂阍|胆.利用可 |.|以囚*| 口| 士 L，|丁|II川|里1 D71+JE-S中中F Fil Cdufins WHhTUS CanctnlrjiiiD 川博|内随I AIM Y借|1_|必3kMw |T卜户r m 刖 1: 9«es.£ iS rural 螳乩山出渴迪3 M Rew-£| Shti得n wi Cdims5art Coh

16、mm；55jrt WnrbhretO.D1i4JWK Q.D15K O.D15 。3强得出数据表2,选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表DnwftdEpm. V部淄评时4、Serf Rpnge $E WOrkMC选定sd列，右击一>Set As>Y Error,将标准方差设为误差棒 j i i j m i j_i i* in i i i1 y.tizj»j*jiJcurtalIl-tJ 二i 山 |TUB|X；如0nlv«m'm孙HEMCO- I丽I卜1_30 31KWREJ57 14iaE41 DTJjaE-5Z5E-2跖。15加对T_a

17、4 Hi如J QRl Cap. fl PurtD31八咐中西战222OWii.中同制片4U1ELCLOJ1WD 01111Q.011432 WE-64知国G.«1«25口口 1M6D0157O.M4732E3E-：5dtv曰EQ力湖0 0157*期瓶M】谓i i5W$E-Iftun Oahba 二ar43E 52T13330,31517DQ1ia?。口 1:5¥:巧HBE行 14 6606R165540.D170Q1MDDD1739O.D17£3用的iJdTQI口1114325T1fi皿mix.a续喀知的 卜|X XY Y z zM ai12117 S&

18、lt;l Cdrni Vn*一 Rll Sbm witti,11115wt Cdinw,1Swl: Wkshwl卜由 label修 CHsreijard藤17伯Norn-jizr X Errwsiwjuwcy Cowt| Z| Stalhfc 的 CiAjmn?.II-4494 JT d1与v-17V M2 1F 11 鼠1 J11H&口 20B490 睡 0 M3 iS£-31SUE140 14AimM11ph? prill rs-ii。TMB Canci-nira1ion(iM|选定X歹U、Mean列和sd列，画点图Fife Edh VW Plai Cdiinn Amip

19、is Tods Rxnwt Wimfcw HppaasaaRiaRi纥嗜.阖回日| g修| a, ir.a a 3里画里| 工隹圈| 则身如I叁:瞑曰|府3WI曰丁I川川川修1mi*胆IS17 9JtSlE |DDB2制 b* 口8口 Kfi iH>3 iS£)3 14b 10TUB 匚nnDtnlrarn口 11,出|点击 Analysis>Non-linear Curve Fit ,作非线性拟合ph Ma 即可函Tods FcFiHt VriFxfcw HeJpJmmjfthrg11IFT 研E3卜但,paftdaot,加*g。Miiljpta CiiiW. Jn&#

20、187;rpi3bu.iia/apobiA_. £FL_FSinwr Ft 酎EOEd一Ft Eipoeflrtia DKiy>Ft Ekpomfflai Grgw小Ft Slgmoil Fitjlamfsian " LDjerttian 城网II明唯5+TF4B G w刖Wi 二川 Ml拟合的方程为米氏方程y=P1*x/(P2+x) , y为反应初速度,x为底物浓度，P1为Vmax值,P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程,可点击New新建方程，之后也可点击Edit编辑方程）Start Fiting ,得出对u.wunii miwiDataset,ManUnurC

21、urn? Fitting: Fhting.,设定P1、P2初始值为1 ,dit33E)TM&腼用-MJW Gruph2点击10lter进行非线性拟合，斛g中中鼻3431 33J-3-3S44K-,记录Vmax和Km值。可双击X或Y轴修改坐标轴名称had = ,rE«J U "W6响 氐1 F.件事诩后苒EJMnC：用Mun时切4uf；wTHH京flA曲131*工1白的皿加LTMB 匕GnuEmlralwM阈）点击图上方的“ T”标志stetiE12QD I 也。Rt EdR Vfew Graph 曲 Ma啊? Todi FoeWWott 也IpnaftBa.RiR|

22、ia|R|国圃阈旦凰置置第刺园圜日画剑曲便陋i国 亚理m制E性i *&*.口 <1 iJ&phlsr-11=1* MEAN |可在图上插入文本框，将Km和Vmax值写入TMO Ccncnbrabar IuMi/ W间阈阖蚓序匕1口5、保存结果。6、计算Kcat值Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。根 据下面的公式计算：vmaxV 二l（1）E=7（2）二 r3 ： Na V3，, , vKcat =EV的单位为Ms-1； Vmax为非线性拟合得出的值，单位为s-1; e =39000M-1 cm-1 ； l为反应体系的高度，96孔板

23、每个孔的高度为1cm,每个孔的容积为 300L,可根据反应体系的平均体积占300 dL的比例来计算反应体系的高度；E为催化剂的浓度，单位为 M; m为催r为催化剂粒子的半化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出;径，以透射电镜测出的粒径计；p为催化剂的密度，单位为 g/cm-3; Na为阿伏伽德罗常数,值为6.02X 1023; V为反应体系的平均体积；Kcat单位为s-1。附：直接拷数据方法:1.每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt,该文件拷入自带u盘。2.选中该记事本文件，右

24、击打开方式，选择用写字板打开，如图ETg,.gH点鞋距t方日照大小E R *l兄1£E3降tn3O4gffl2:那鲁的S®S5-:骊越双 注-.8GXBBAEy噌因y甥勘B匚皿 j.加 fl ita科刘Ik也2D1O-7-92017-12010-7-142010-7-15JOWbT-l£同事E ifwe国 il画aj%町也i el等J惊爵 1 EOC20IQ-7-J7- 口距2QW-7-37- 京峰和8*ZI2U1W-W-3L1戢川雨 ii%ififi：-.mslin®jif Mkrwo lichee解15但也幅IfcE物IK打粉8K力密,立曲KSl.t

25、iKF上 3CM§W加5显7_s&EM/.lZ.ffaJlT.L.也2A1O-7-16；色 胪舵也Explorer：14本7己本加琳24画的政工22叫soio-r?2A1O-7-212010-7-21-22DL0-7-23-23010-7-263MO-7-272D1Q-7-2.刘瓯19»1W回1师时 桐眄 9MJEI器瞅A息明口-标公目民为事帚襄垣Airrttfir日嘀磔矽甘瓠国现Jg霞L-Stcftl 'mOMTSjarrn囹酢"Ef Ir堡哂 a2&LK25/dr 界 £-mal.貂Gm也如口 E：陶!3 叫/2Q1O0B25

26、 号宝日 2012510:15尔E扣T： 4与咫?渭日如期8声iftl-Si打开后如下:Ml WK 巧gR/U彘苣第1 3=H.AIEW=aOE2EMI_TlT TEn=IKTIKE OKO niomri Kodil QBD ll4ropUr t 虐ATEK 的愉刘W蛛卧I。Mix.f glt«r=|.baixn 4. 3I5E Q.初1 0.4OB 0.，舶 L.却口 2. OLE L.SK L. MD树胜 .nil口.崩 Q.2Z5I 0.3BD 0.715 i.S5t 2.1304 1.903 I.31EEL 1.3 Dl H6 弧224 DUZ73 0.1 D.ML 口峋出6

27、制 1.514 L电的 1.9B 3-B9O k93l L0W5 3.7S? aTE3CM 4. MG 4k M4 Q.国年 &国U Q. AO 以 Mb0.M4 a.Mg ID.H4 a. MG (LD44 0. ME &D14 a. MCa. M3 n.oo Q.C41 2 04, 0.Q4P 0.0U qg g,M3 a.M.a. ME 讯03 n.M< D.D44 a., o.q«0.04. DlD4 D.fHT DllMl 0.043 DIM? & M3 QlO« LM1 LD4q 0.044 DLD4 DL044 DLD44 D.

28、0-4.4 D-Qia EM。0.M3 丸回】Qi MZ 9rMT Q.CNT 上阿队阿1 QLM3 a.1042 0.D4J 0.C-43 0lM3 0： M3 %, M4 Q. MlH.ftJEIT=(IQM5IME_Tl.T rE5T=HEJTHE QRTO DIO-UP Ko4-1 4W HcnpKr t FEAJCR 蹒/的和W »=ST l«x. f-iltHE： L .brgxnQ. M0. L430. LilEL HflCl M2机MZ口口£D.Q4?IL M2a DU口国£小23q. mQ.2ZE0.ZZ1DLE3LdDI1Q>.