蛋白质等电点测定

1、蛋白质等电点测定及性质实验、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷 数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上 带电表面和反离子 形成了双电层的结构。在两种不同物质的 界面上，正负电荷分别排列成的面层。对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmhol

2、z提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chap man修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来 Stern又提出了 Stern模型。根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成 吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的 扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在 扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。滑动面：指固

3、液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为Z电势。固体颗粒带电量的大小及测量方式？Z电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。Z电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1? 100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团

4、都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正在碱性溶液中竣基形成-C00一而带负电电， COO-COOJ + 0H- NH2 兼性痒孑 pH>pI pK = pl

5、pl电殛申：拓向配覆不暮动蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为:在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白质等电点的测定各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等

6、电点是4.74.8 ，血红蛋白等电点为6.76.8 ，胰岛素是5.35.4 ，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH12.012.4 。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也 简便。蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。等电聚焦电泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点

7、（pl ）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。IEF 的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一 pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl ）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位

8、置上，形成分离的蛋白质区带。沉淀反应：蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。主要的沉淀现象有（1）盐析：在蛋白质水溶液中加入足量的盐类（如硫酸铵），可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分离与初级提纯。（ 2）变性：在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下，引起蛋白质某些理性质改变和生物学功能丧失。这是一个不可逆过程。4 ）加入生物碱试剂（含氮的碱性物质）（ 3）加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时:能使生物碱沉淀或作用产生颜色反应的物质，称为生物

9、碱试剂。当溶液的 试PH小于PI时，蛋白质为阳离子，能与生物碱剂的阴离子结合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分，常温下在水中可溶解 0.81.2%,微溶于25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分。当浸入水中则迅速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。构造极为复杂，没有确定的分子式。分子量约为57000375000,在牛奶中约含 3%占牛奶蛋白质的 80%三、器材及试剂：1 .器材：试管1.5X厘米（X 9）。吸管1毫升（X 2） , 2毫升（X 2） , 10毫升（X 2）。 容量瓶50毫升（X 2） , 500毫升（X 1）。试管架。2 .试剂：0.01mol

10、? L-1醋酸溶液。0.1mol ? L-1醋酸溶液。1 mol ? L-1醋酸溶液。1 mol ? L-1氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。酪蛋白。四、操作步骤：1 .制备蛋白质胶液（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入 40C的蒸储水。（2）加入50毫升1 mol ? L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸储水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。（3）在容量瓶中再加入1 mol ? L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。（4）加入蒸储水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1 mol ? L-1NaA0液中的酪 蛋白胶体。2

11、 . 等电点测定按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸储水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。管号蛋白质胶液（金）H20（金）-10.01 mol ? LHAC-10.1mol ? LHAC（»#）1 mol ? L-1HAC（»#）PH观察0分钟10分钟20分钟118.380.625.9217.751.25一一5.6318.75一0.25一5.3418.50一0.50一5.0518.00一1.00一4.7617.00一2.00一4.4715.00一4.00一4.1811.00一8.00一3.8917.40一一1.603.5观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪

12、蛋白的等电点。观察时可用+, +, +,表示浑浊度。3 .蛋白质性质实验(1) 蛋白质的盐析在试管里加入12毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸镂饱和溶液，观察现象，有无白色浑浊产生。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸镂饱和溶液。(2) 蛋白质的变性在试管里加入2毫升蛋白质的水溶液，沸水浴加热5分钟，观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。在试管里加入3毫升蛋白质的水溶液，加入 1毫升硫酸铜溶液，观察现象。(有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生)。把少量沉淀放入盛有蒸储水的试管里，观察沉淀是否溶解。五、思考题1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本实验中，酪