分子生物研究法(上)

1、第五章第五章 分子生物学研究法（上）分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术从从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。和基因工程技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分扩增等，是分子生物学研究的核心技术。子生物学

2、研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物

3、的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。工程技术区别于其它技术的根本特征。5.1 重组重组DNA技术回顾技术回顾5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.4 SNP的理论与应用的理论与应用5.5 基因克隆技术基因克隆技术5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术5.1.1 三大奠基三大奠基成就成就 ：DNA的结构及复制；的结构及复制；5.1 重组重组DNA技术发展史回顾技术发展史回顾DNA是遗传物质；是遗传物质；DNA的遗传和表达规律的遗传和表达规律中心法则。中心

4、法则。40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLiving S cellsLiving R cellsHeat killed S cellsHeat killed S cells mixed with living R cellsLiving S cells in blood sample from dead mousecapsule1928 Frederick Griffith &1

5、944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae 1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验50年代揭示了年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-ray sourceCrystallized DNARosalind FranklinMaurice WilkinsPhotographicfilm1953- Franklin & WilkinsDescription of t

6、he 3-D structure of DNAFrancis Crick & James WatsonConservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway50年代末至年代末至60年代，

7、相继提出了年代，相继提出了中心法则中心法则和操纵子学和操纵子学说说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。和表达。Jacob and Monod DNA DNA提取技术：提取技术： 如果没有分离和富如果没有分离和富集单一集单一DNADNA分子的技术，科学家就无法分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。对这类物质进行直接的生化分析。 5.1.2 DNA 5.1.2 DNA操作技术操作技术DNA的体外切割和连接的体外切割和连接1962年年Arber 发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了发

8、现了 DNA 连接酶连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands RestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535Herbert Boyer, Paul Berg(美国斯美国斯坦福大学坦福大学 )于于1972年获得年获得第一个重组第一个重组DNA分子分子H. BoyerP. BergSV40 DNARecombinant DNA 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接连接酶进行酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需的切割和重组远不能满足基因研究的需

9、要。要。 DNA片段在体外片段在体外不具备自我复制不具备自我复制能力，要想得到能力，要想得到足够量和足够纯度的足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备，必须将它们连接到具备自主复制能力的自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆这就是基因克隆，或分子克隆 。 基因克隆技术基因克隆技术 分子克隆的载分子克隆的载体体-具备自主具备自主复制能力的复制能力的DNA分子（分子（vector），如），如病毒、噬菌体病毒、噬菌体和质粒等小分和质粒等小分子量复制子都子量复制子都可以作为基因可以作为基因导入的载体

10、。导入的载体。大肠杆菌成为分子克隆中最常用的转化受体。大肠杆菌成为分子克隆中最常用的转化受体。1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量发现，大肠杆菌细胞经适量CaCl2处理处理后，能有效地吸收后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经等人又报道，经CaCl2处理的大肠杆菌细处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒胞同样能够摄取质粒DNA。1973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHer

11、bert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies非洲爪蟾非洲爪蟾表明：表明： （1 1）像）像pSC101pSC101这样的质粒这样的质粒DNA

12、DNA分子可分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源以作为基因克隆的载体，从而把外源DNADNA导入寄主细胞；导入寄主细胞；（2 2）像非洲爪蟾这样的高等生物的）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；中并实现其功能表达；（3 3）质粒）质粒DNA-DNA-大肠杆菌细胞作为一大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，在重组种成功的基因克隆体系，在重组DNADNA或基因工程研究中发挥重要作用。或基因工程研究中发挥重要作用。重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸

13、内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端（进行末端标记末端（进行

14、末端标记实验或用来进行实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团 到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳

15、技术将这些片段按照分子量大成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。小逐一分开，以供下一步研究。 DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发展起来的一门重要的学的基础上创立并发展起来的一门重要的DNA技术技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。着十分广泛的使用价值。5.1.3 重组

16、重组DNA技术历史上的主要事件技术历史上的主要事件 年份年份事事 件件 1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T. Avery证实证实DNA是遗传物质。是遗传物质。1952A.D. Hershey和和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和和F.H.C.Crick提出提出DNA分子结构的双螺旋模型。分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用用X-射线衍射法证实了这一结构。射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA

17、聚合酶聚合酶I。1958M. Meselson和和F. W. Stahl提出了提出了DNA的半保留复制模型。的半保留复制模型。1959-1960S. Ochoa发现发现RNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNA，并证明，并证明mRNA决定了蛋决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；破译了第一相遗传密码；F. Jacob和和J. Monod提出了提出了调节基因表达的操纵子模型。调节基因表达的操纵子模型。1964 C. Yanofsky和和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序

18、列存在着共线性关系。该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由科学家证明细菌的抗药性通常由质粒质粒DNA所决定。所决定。1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破等人破译了全部遗传密码。译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸分离了第一种限制性核酸内切酶。内切酶。H.M.Temin和和D.Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发现反转肿

19、瘤病毒中发现反转录酶。录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了等人发展了DNA重组技术，于重组技术，于72年获得第一年获得第一个重组个重组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了等人发明了DNA序列测定技术。序列测定技术。1977年完成了全长年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。岛素。1980美国联邦最高

20、法院裁定微生物基因工程可以专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R. D. Palmiter和和R. L. Brinster获得转基因小鼠；获得转基因小鼠；A. C. Spradling和和G. M. Rubin得到转基因果蝇。得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素；胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。1983 获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984 斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986 GMO首次在环

21、境中释放。首次在环境中释放。1988 J. D. Watson出任出任人类基因组计划人类基因组计划首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠-Oncomouse。1992 欧共体欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。完

22、成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完黑猩猩基因组全序列测定。中、美、日科学家联合完黑猩猩基因组全序列测定。5.1.4 基因克隆技术及其相关概念 酶简介 载体简介 细菌转化及筛选 鉴定重组子 基因克隆举例限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)(restriction end

23、onuclease, RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 分类分类:、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；斜体第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；斜体第四个字母代表菌株；第四个字母代表菌株；罗马数字表示发现的先后次序。罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构

24、回文结构(palindrome)即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口 DNADNA连接酶连接酶: : 通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片片断连接成一个整体断连接成一个整体DNADNA分子。分子。 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 E.coli -DNAE.coli -DNA连接酶连接酶 T T7 7DNADNA连接酶连接酶目

25、的基因的来源目的基因的来源 原核细胞原核细胞 真核细胞：真核细胞：cDNA或或gDNA文库文库 人工合成及人工合成及PCR扩增目的基因扩增目的基因 天然天然DNADNA（染色体（染色体DNADNA、病毒、病毒DNA(DNA(噬菌体噬菌体DNA)DNA)、质粒质粒DNADNA、线粒体、线粒体DNADNA和叶绿体和叶绿体DNADNA） 重组实验中的主要载体重组实验中的主要载体定义：定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些达蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为

26、使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) (expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成多序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制能自主复制； 具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记物，便于重组体的筛选物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定； 有多克隆位点有多克隆位点（外源（外源DNADNA插入点），常具有多个单插入点），常具有

27、多个单一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。 噬菌体载体：噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体噬菌体噬菌体载体的特点：噬菌体载体的特点：1 1、克隆的、克隆的DNADNA有大小限制。有大小限制。2 2、和外源、和外源DNADNA连接后，都要经过体外包装过程，连接后，都要经过体外包装过程，把重组的把重组的DNADNA包进头部，和尾部装配成有感染性包进头部，和尾部装配成有感染性的噬菌体。的噬菌体。3 3、如果没有外源、如果没有外源DNADNA插入，载体本身的插入，

28、载体本身的DNADNA太小太小是不能被包装的，这样可确保转化后产生的空是不能被包装的，这样可确保转化后产生的空斑是重组体。斑是重组体。4 4、重组的、重组的DNADNA由于利用噬菌体把它注入细胞由于利用噬菌体把它注入细胞中，因此和重组质粒中，因此和重组质粒DNA DNA 转化相比，具有高得转化相比，具有高得多的转化率。多的转化率。Cos质粒载体：又叫粘粒载体（质粒载体：又叫粘粒载体（cosmid），是），是带有带有 cos 位点的质粒，是由位点的质粒，是由噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。和质粒构建而成。 柯斯质粒载体含有来自质粒柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记

29、、一个或多个限的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自制酶单一位点，以及来自噬菌体粘性末端的噬菌体粘性末端的 DNA 片段，即片段，即 cos 位点，其对于将位点，其对于将 DNA 包装包装成成噬菌体粒子是必需的。噬菌体粒子是必需的。结构图结构图 cos质粒的结构质粒的结构柯斯质粒载体的优点：柯斯质粒载体的优点： 具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在； 具有质粒具有质粒 DNA 的复制方式，重组的复制方式，重组 DNA 注入宿注入宿主细胞后，两个主细胞后，两个

30、 cos 位点连接形成环状位点连接形成环状 DNA 分子，分子，如同质粒一样进行复制；如同质粒一样进行复制； 具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源 DNA 的能力，柯斯质粒本的能力，柯斯质粒本身一般只有身一般只有 57kb 左右，而它可克隆外源左右，而它可克隆外源 DNA 片片段的极度限值竟高达段的极度限值竟高达 45kb ，远远超过质粒载体及，远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。这是其最大优点。噬菌体载体的克隆能力。这是其最大优点。黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC ：高容量载体高容量载体单个克隆载体所容纳的外原单个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小片段的大小 质粒：质粒：10k

31、b 噬菌体：噬菌体：23kb 黏粒：黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程?细菌转化细菌转化细菌转化（细菌转化（transformationtransformation） ：p163p163感受态细胞（感受态细胞（Competent cells） ：受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称这种状

32、态下的细胞称将异源将异源DNADNA分子引入一细胞株系，使受体细胞分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状获得新的遗传性状供体供体 受体受体转导？转导？ 转染？转染？ 常用的转化方法：常用的转化方法： 化学转化（化学转化（CaCl2）法）法 电击法电击法 PEG介导转化介导转化 人工体外包装人工体外包装 化学转化原理：化学转化原理： 在在0冷冻处理时，处于冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内，然后

33、在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。复原并增殖，表达外源基因。电击转化：电击转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。菌液：生长对数期菌液：生长对数期场强场强(最大转化效率最大转化效率)：12.5-15kV/cm 温度：温度：0-4 克隆的筛选：克隆的筛选： 抗生素基因。抗生素基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等素、四环素、链霉素等 -互补蓝白斑筛选互补蓝白斑筛选 电泳检测法电泳检测法

34、 营养条件（自养、异养）营养条件（自养、异养）pBR322AmpTet -互补筛选互补筛选 质粒质粒: -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列）的调控序列和氨基端（和氨基端（N端）端）146个氨基酸编码序列个氨基酸编码序列 宿主细胞宿主细胞: 编码编码-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）部端）部分序列分序列 添加添加 IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑的培养基上筛选蓝白斑蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色）（白色） （蓝色）（蓝色） Lac Z（失活）（失活） , IPTG X-gal X-gal （白色）（白色） （白色）（

35、白色）蓝白斑蓝白斑例1. General process of gene engineering1. 1. 从生物有机体基因组中，分离从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的出带有目的基因的DNADNA片段。片段。2. 2. 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNADNA片段片段和载体分别进行酶切。和载体分别进行酶切。4. 4. 将重组将重组DNADNA分子转移到适当的受体细分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。5. 5. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组得了重组DNADNA分子的受体细胞，并筛

36、选出分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。已经得到扩增的目的基因。3.3.将酶切片段与具有选择记号的载将酶切片段与具有选择记号的载体连接，形成重组体连接，形成重组DNADNA分子。分子。+5.1 重组重组DNA技术回顾技术回顾5.2 DNA基本操作技术基本操作技术5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.4 SNP的理论与应用的理论与应用5.5 基因克隆技术基因克隆技术5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术5.2 DNA基本基本操作技术操作技术 5.2.1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyac

37、rylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：许多分子生物学研究方法，如： DNA分型、分型、DNA核核苷酸序列分析、限制性内切酶片段苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。重视。 一种分子被放置到电场中，它就

38、会以一定的速度移向一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的速度，叫做电泳的迁移率迁移率，它与电场强度和电泳分子本，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳，反之则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故定的支持

39、介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。 已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。分子混合物中的各种成分彼此分离开来。基本原理基本原理 在生理条件下，核酸分子之糖在生理条件下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状磷酸骨架中的磷酸基团，是

40、呈离子化状态的，所以，态的，所以，DNA和和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子分子的这种迁移速度，

41、亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。本身的大小和构型。大分子量的大分子量的DNA移动的慢移动的慢小分子量的小分子量的DNA移动的快移动的快电泳缓冲液电泳缓冲液阳极阳极阴极阴极DNA加样孔加样孔DNA Marker及其作用及其作用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间之间聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1个碱基对到个碱基对到1000个碱基对之间个碱基对之间凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖50 000

42、1 0000.7%琼脂糖琼脂糖20 0001 0001.4%琼脂糖琼脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 在凝胶电泳中，加入适在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（量溴

43、化乙锭（ethidium ethidium bromidebromide，简称，简称EtBrEtBr）染料对核酸分子进行染染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中出凝胶介质中DNADNA的谱的谱带部位，即使每条带部位，即使每条DNADNA带中仅含有带中仅含有0.050.05g g的的微量微量DNADNA，也可以被清，也可以被清晰地检测出来。晰地检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光分子发出荧光称样称样溶解溶解加热加热制板制板倒胶倒胶电

44、泳操作基本程序电泳操作基本程序取样取样点样点样电泳电泳检测检测结果结果5.2.35.2.3聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一是一种在体外快速扩增特定基因或种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法序列的方法。PCR最初的原始雏形概念是类似最初的原始雏形概念是类似基因修复复制基因修复复制，它，它是于是于1971年由年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。前两个周期反应）的实验。而现今所发

45、展出来的而现今所发展出来的PCR则于则于1983年由年由 Dr. Kary B. Mullis提出，并于提出，并于1985年与年与 Saiki 等人正式发表了第一篇相等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，关的论文。此后，PCR技术在生物科学研究和应用中得以广技术在生物科学研究和应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此也因此获得了获得了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1.变性变性（90-96） 在加热或碱性条件下可使在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。，称

46、之为变性。2.退火退火（25-65） 是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。片段。3.延伸延伸（70-75） 从结合在特定从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。链。标准的标准的PCR过程分为三步：过程分为三步： PCRPCR反应体系反应体系 引物引物 dNTPdNTP MgMg2+2+ TaqTaq聚合酶聚合酶 模板模板 反应缓冲液反应缓冲液u引物设计的基本原则：引

47、物设计的基本原则：1.引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp，常用的是，常用的是18-27 bp，但不，但不应大于应大于38bp，因为过长会导致其退火温度大于，因为过长会导致其退火温度大于74，不，不适于适于Taq DNA聚合酶进行反应。聚合酶进行反应。2.引物序列引物序列3端出现端出现3个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如GGG或或CCC，也会使错误引发机率增加。也会使错误引发机率增加。 3.引物引物3端的末位碱基对端的末位碱基对Taq酶的酶的DNA合成效率有较大的影合成效率有较大的影响。末位碱基为响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3个碱基，因此个碱基

48、，因此应当避免在引物的应当避免在引物的3端使用碱基端使用碱基A。另外，两条引物。另外，两条引物3端若端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反反应失败。应失败。4.5端序列对端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等荧光素、地高辛等. 通常应在通常应在5端限制酶位点外再加端限制酶位

49、点外再加1-2个个保护碱基。保护碱基。5.引物序列的引物序列的GC含量一般为含量一般为40-60%，过高或过低都不利，过高或过低都不利于引发反应，因为于引发反应，因为GC含量决定了含量决定了DNA双链的解链温度双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。 6.一般一般PCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。过低则降低产量。用用NaOH 将将pH调至调至7.0。 dNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/

50、L并分装并分装, -20贮存。一般反应中每种贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L。 理论上理论上4 种种 dNTP各各20mol/L, 足以在足以在100l反应中合成反应中合成2.6g的的DNA。当。当dNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L时可抑制时可抑制Taq DNA聚合酶的聚合酶的活性。活性。4种种dNTP的浓度应该相等的浓度应该相等, 以减少合成中由于某种以减少合成中由于某种dNTP的不足的不足出现的错误掺入。出现的错误掺入。 udNTPdNTPuPCRPCR反应体系反应体系- Mg- Mg2+2+Mg 2+浓度对浓度对Taq DNA聚合酶影响很大

51、聚合酶影响很大, 它可影响酶的活性和真实性它可影响酶的活性和真实性, Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性浓度过低，会显著降低酶活性; Mg 2+浓度过高又使酶催化非浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。特异性扩增增强。 Mg 2+浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。通常通常Mg 2+ 浓度范围为浓度范围为0.5-2mmol/L, 1.5mM最佳。最佳。uPCRPCR反应体系反应体系- Taq- Taq聚合酶聚合酶扩增效率最高扩增效率最高, 1000 bp/min 活性活性5-3 DNA聚合酶活性强聚合酶活性强无无3-5 DNA

52、外切酶活性外切酶活性, 错配率每个循环约错配率每个循环约1/6000 3末端加末端加“A” , 产物可直接进行产物可直接进行“TA”克隆克隆pfu酶酶保真度高保真度高原理原理: 具具35核酸外切酶活性，即校正功能。核酸外切酶活性，即校正功能。效率相对较低效率相对较低, 500 bp/min 3末端不加末端不加“A”，加，加A后才可进行后才可进行TA克隆。克隆。就模板就模板DNA而言而言, 影响影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板浓度为一般反应中的模板浓度为 50-100 ng/ml。模板量过多则可能增加非特异性产物。模板量过多则可能增加非特异性

53、产物。 DNA中的杂质也会影中的杂质也会影响响PCR的效率的效率.uPCRPCR反应体系反应体系- -模板模板DNADNAuPCRPCR反应体系反应体系 PCR PCR反应缓冲液反应缓冲液缓冲液一般含缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的和适当浓度的Mg 2+ . 另外，反应液可加入另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇的二硫苏糖醇(DDT)或或100g/ml的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性。它们可稳定酶活性。在第一轮循环前在第一轮循环前,在在94下变性下变性3-5min非常重要，它

54、可使模板非常重要，它可使模板DNA完全解链。变性不完全，往往使完全解链。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性失败，因为未变性完全的完全的 DNA双链会很快复性，减少双链会很快复性，减少DNA产量。产量。对于富含对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。或时间过长都会导致酶活性的损失。引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度

55、比扩增引物的的退火温度比扩增引物的Tm值约低值约低5，时间一般为，时间一般为20-60s。延伸反应通常为延伸反应通常为72，接近于，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温聚合酶的最适反应温度度75。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从聚合酶的作用温度范围可从20-85。 一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(5-10 min)的的延伸反应。延伸反应。以获得尽可能完整的产物以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。测序反应尤为重要。当其

56、它参数确定之后，循环次数主要取决于当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般浓度。一般而言而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中产物中非特异性产物大量增加。非特异性产物大量增加。 如果此时产物量仍不够，如果此时产物量仍不够， 需要进一步扩增，可将扩增的需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经行扩增，这样经60轮循环后，轮循环后， 扩增水平可达扩增水平可达109-1010 。PCR反应程序反应程序:PCR技术在基因克隆方面的应

57、用技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆，）目的基因的直接克隆， （2）通过）通过RT-PCR进行进行cDNA的克隆；的克隆； （3）制备）制备DNA探针，进行分子检测等。探针，进行分子检测等。 5.2.4. 实时定量实时定量PCR 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定

58、量分析。之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 实时荧光定量实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素：技术中的一些重要因素： Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 Ct值与起始模板的关系，每个模板的值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量中荧光化学，荧光定

59、量pcr所使用的荧光所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：如下： TaqMan荧光探针荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基

60、外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。 SYBR荧光染料荧光染料：在：在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光荧光染料，染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与号，