基因工程实验ppt课件

1、 基因工程大实验基因工程大实验E.Coli 感受态细胞的制备、质粒感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、的转化、提取与酶切鉴定提取与酶切鉴定 一、 实验目的和要求 1、经过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术；2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分别、提取质粒DNA的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 经过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研讨中的意义与作用。 二、实验原理二、实验原理 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处所谓感受态是指受体

2、细胞处于容易吸收外源于容易吸收外源DNA的一种生理形状，可以经过物的一种生理形状，可以经过物理与化学方法诱导构成，也可以自然构成，在基因工理与化学方法诱导构成，也可以自然构成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞普通是限制胞普通是限制-修饰系统修饰系统Restriction-Modification缺陷的变异株，以防止对导入的外源缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，的切割，用符号用符号R-M-表示。其根本原理是：细菌处于表示。其根本原理是：细菌处于0的的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性低渗溶液中，会膨

3、胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒发生变化，转化混合物中的质粒DNA构成抗构成抗DNase的的羟基羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞外表，经过钙磷酸复合物黏附于细胞外表，经过42短时短时间的热激处置，间的热激处置， 促进细胞吸收促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培育基上生长数小时后，复合物，在丰富的培育基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培育基上可获得所需的转化球状细胞复原并分裂增殖，在选择培育基上可获得所需的转化子。子。 2、碱裂解法小量制备质粒、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大：碱裂解法是基于线性大分子染色体分子染色体DNA与小分子环形质粒与小分子环

4、形质粒DNA的变性、复性的差别的变性、复性的差别到达分别目的的，在到达分别目的的，在pH12.012.6的碱性环境中，线型染色体的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒质粒DNA由于其闭合环型构造，氢键仅发生部分断裂，而且由于其闭合环型构造，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分别；当将其互补链不完全分别；当将pH值调理到中性并在高盐浓度下，值调理到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联构成不溶的网状互补链不能复性而交联构成不溶的网状构造，经过离心，大部分染色体构造，经

5、过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子RNA和蛋白和蛋白 质质-SDS复合物等一同沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合复合物等一同沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性形状保管与溶液中，离心后上清中便含有所需求的呈可溶性形状保管与溶液中，离心后上清中便含有所需求的质粒质粒DNA。 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链识别双链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪水解酶，是体

6、外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，酶的识别切割特性， 催化条件及能否具有修饰酶活性可分为催化条件及能否具有修饰酶活性可分为、III型三大类，型三大类，类和类和III类限制性内切酶，在同一蛋类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回 (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别一样的序列，甚至切割的位点也一样，称、有不同来源的限

7、制性内切酶可以识别一样的序列，甚至切割的位点也一样，称为同裂酶或异源同工酶，如为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与与Msp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNA切割后可切割后可产生一样的粘性末端，称为同尾酶，如产生一样的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与与Bgl II。 影响核酸限制性内切酶活性的要素：影响核酸限制性内切酶活性的要素： DNA的纯度；的纯度； DNA的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反响的温度；酶切消化反响的温度； DNA的分子构造；的分子构造； 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。 4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂

8、糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能构成带具有一定外形、大琼脂糖溶化再凝固后能构成带具有一定外形、大小与孔隙度的固体基质小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子；而生理条件下，核酸分子的糖的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化形状，因此将核酸分子置于电场中时，磷酸骨架中磷酸基团呈离子化形状，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在构造上的反复性，一样数量的双链磷酸骨架在构造上的反复性，一样数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的

9、速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的分子量较小的DNA分子，比分子量较大的分子，比分子量较大的DNA分子，具有较严密的构型，分子，具有较严密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的分子要快。直接用低浓度的EB进展染色，可确定进展染色，可确定DNA在胶中的位置。在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的要素：迁移率的要素： DN

10、A的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； DNA构象；构象； 电场强度；电场强度； 碱基组成与温度；碱基组成与温度； 嵌入染料的存在；嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。电泳缓冲液的组成。 三、实验资料与设备：三、实验资料与设备：1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净任务台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培育箱、恒温振荡器、超净任务台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培育箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；电泳槽、紫外透射仪，凝胶成

11、像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 管、管、tip头头 、烧杯、量筒、烧杯、量筒 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水吸水纸，一次性塑料手套等；纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5受体菌受体菌(R-M-)， pTRE2hyg质粒质粒(AmpR)2、试剂：、试剂： LB培育基培育基:蛋白胨蛋白胨 10g/L，酵母提取物，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉，琼脂粉 15g/L固体培育基，用固体培育基，用10 mol/L的的NaOH调理调理pH为为7.0，高压灭菌；，高压灭菌；

12、 氨苄青霉素储存液：浓度氨苄青霉素储存液：浓度50-100mgmL； 含有抗菌素的含有抗菌素的LB平板培育基：将配置好的平板培育基：将配置好的LB固体培育基固体培育基高压灭菌后，冷却到高压灭菌后，冷却到60度左右，参与氨苄青霉素终浓度为度左右，参与氨苄青霉素终浓度为50gmL浓度浓度50-100gmL； 0.1mol/LCaCl2 0.1mol/LCaCl2：称取：称取1.1g1.1g进口无水进口无水CaCl2CaCl2，溶于，溶于70mL70mL双蒸双蒸水中，定容到水中，定容到100mL100mL，过滤后灭菌；，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl2 15 0.1mol/LCaCl2 15

13、甘油：甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内溶液内含有含有15ml15ml甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌； 溶液溶液I: 50mmol/LI: 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用现配现用) )； 溶液溶液III: III: 乙酸钾溶

14、液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL的的5mol/L KAc, 5mol/L KAc, 11.5ml 11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2O)28.5mL H2O)； RNase A RNase A： 10mg/ml 10mg/ml； TE TE缓冲液缓冲液: 10mmol/L: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/LTris-HCl, 1mmol/L，EDTAEDTA，pH pH 8.08.0； 5TBE缓冲液：缓冲液：0.45mol/L Tris硼酸，硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10Loa

15、ding buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，溴酚兰，50的甘油；的甘油； 无水乙醇；无水乙醇； 70乙醇；乙醇； 规范分子量片段；规范分子量片段； 核酸内切酶核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液酶解缓冲液(10 buffer H)； 琼脂糖；琼脂糖； 溴化乙啶溴化乙啶EB染色液染色液(10mg/ml)。 四、操作步骤四、操作步骤: (一一) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1、重新活化的、重新活化的E.coli DH5平板上挑取一单菌落，接种于平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培育中，液体培育中，37振荡培育至对数生长期振荡培育至对

16、数生长期(12h左左右右)； 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:50转接于转接于100ml LB液体培育液体培育基中，基中，37振荡扩展培育，当培育液开场出现混浊后，每隔振荡扩展培育，当培育液开场出现混浊后，每隔2030min测一次测一次OD600，至，至OD600为为0.30.5时停顿培育，时停顿培育，并转装到并转装到1.5 mL离心管中；离心管中； 3、培育物于冰上放置、培育物于冰上放置20min； 4、 04，4000g离心离心10min，弃去上清液，参与，弃去上清液，参与1 mL冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞, 冰浴冰浴20分钟；分

17、钟； CaCl2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离心离心10min，倒净上清培育液，再用，倒净上清培育液，再用1.0 mL冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液悄然悬浮细胞，冰浴溶液悄然悬浮细胞，冰浴20min； 6、 04， 4000g离心离心10min，弃去上清液，参与，弃去上清液，参与100 L冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

18、 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，假设在、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，假设在4放置放置1224h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高46倍；也可参与占倍；也可参与占总体积总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心离心管中，置于管中，置于-70条件下，可保管半年至一年。条件下，可保管半年至一年。 二质粒二质粒DNA的转化：的转化： 1、每、每100L感受态细胞悬液中参与感受态细胞悬液中参与1L质粒质粒DNA,悄然摇匀，悄然摇匀，同时设置三组对照：同时设置三组对照：(1)不加质粒，不加质粒，(2)不加受体菌，不加受体

19、菌， (3)加知加知具有转化活性的质粒具有转化活性的质粒DNA，详细操作按下表进展：，详细操作按下表进展：*阳性对照，用知具有转化活性的阳性对照，用知具有转化活性的pTRE2hyg质粒质粒DNA进展转进展转化化 编号编号组组 别别质粒质粒DNA/LTE buf / L0.1mol/L CaCl2 / L受体菌受体菌/ L1受体菌对照受体菌对照11002质粒对照质粒对照1（ g）1003转化组转化组I1（ g）1004转化组转化组II *1（ g）100 2、冰上放置、冰上放置2030min，然后，然后42水浴热激水浴热激90120 Sec，迅速冰上冷却，迅速冰上冷却2min； 3、 立刻向上述

20、立刻向上述Ep管中参与管中参与0.8mL LB液体培育基，摇匀液体培育基，摇匀后于后于37振荡培育约振荡培育约1530min ，使受体菌恢复正常生长形，使受体菌恢复正常生长形状及表达抗性基因；状及表达抗性基因； 4、取培育液、取培育液50L接种于含抗菌素的接种于含抗菌素的LB平板培育基上，平板培育基上，用玻璃涂棒涂匀；用玻璃涂棒涂匀； 5、将培育皿放在、将培育皿放在37恒温培育箱培育恒温培育箱培育30 min,待菌液完待菌液完全被培育基吸收后，倒置培育皿，于全被培育基吸收后，倒置培育皿，于37恒温培育箱内培育恒温培育箱内培育过夜过夜(14-16h) ；三碱裂解法小量制备质粒三碱裂解法小量制备质

21、粒DNA: 1、挑取转化挑选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培育基中，、挑取转化挑选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培育基中，37震荡培育震荡培育1216小时；小时； 2、将、将1.5mL菌液参与菌液参与Ep离心管中，离心管中，12000 g离心离心30 Sec，弃上清液，弃上清液，在吸水纸上扣干；在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮。离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮。 3、参与、参与100L预冷的溶液预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；量使细胞分散； 溶液溶液I中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘

22、度，减少提取过程中的机械中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体剪切力，防止染色体DNA 的断裂；的断裂；EDTA的作用是与二价离子的作用是与二价离子Ca2结合，降低结合，降低DNase对对DNA的降解。的降解。 4、参与、参与200L新配制的溶液新配制的溶液II, 盖紧管口盖紧管口,快速颠倒离心管快速颠倒离心管,以混匀内容以混匀内容物物,冰上放置冰上放置35min; 溶液溶液II中的中的NaOH与与SDS可裂解细胞，使可裂解细胞，使DNA变性以及变性以及SDS使蛋白变性使蛋白变性并构成交联的网状构造。并构成交联的网状构造。 5、参与、参与150l溶液溶液III

23、, 加盖后颠倒加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置23min； 溶液溶液III为低为低pH的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性。不能正确复性。 6、12000 g离心离心6 min，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的Ep管中；管中； 7、加、加2倍上清体积倍上清体积(约约1mL)的无水乙醇的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置振荡混匀，室温放置2min. 8、 12000g离心离心10min，弃上清液，再用，弃上清液，再用70的乙醇洗涤一次，的乙醇洗涤一次， 12

24、000g离心离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上枯燥质粒；枯燥质粒； 9、参与、参与40L含含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约约8min)，存于，存于20或直接用于或直接用于酶切。酶切。 (四四)提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1、在、在0.5mL Ep管中依次参与以下溶液于管中依次参与以下溶液于0.5ml离心管中离心管中 提取质粒提取质粒DNA 3.0 L 10

25、 buffer H 1.0 l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8 L 10 L 1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在20 L 反响液中反响反响液中反响1h，使，使1 g DNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量. 2、 悄然混匀悄然混匀, 4000g离心离心10秒秒 ，置于，置于37水浴中酶解水浴中酶解1.5h。 3、酶解完成后，参与、酶解完成后，参与1.2 l 10上样缓冲液上样缓冲液(或或2 l 6上样缓冲上样缓冲液液), 混匀混匀. 4、称取、称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，参与琼脂糖，置于三角瓶中，参与100mL 0.5TBE或或1TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。解。 5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60左右的琼脂糖凝胶液左右的琼脂糖凝胶液参与一小滴参与一小滴EB，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻