根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

1、根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究河南农业科学根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究周延清H,刘艳菊,李敏,段红英,周春娥,王芳,苑保军(1.河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;2.周121市农业科学院,河南周口466001)摘要:通过根癌农杆菌介导法将反义一j基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度,预培养时间,共培养时间,恢复培养时间,乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株.PCR,PCRSouthernblotting检测结果表明,反义一j基因成功转入并整合于大豆基因组.GC检测结果表明,转反

2、义fad2一j基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44,而亚油酸含量降低了20.27.关键词:大豆;根癌农杆菌;反义.一j基因;遗传转化;反义抑制中图分类号:$565.1文献标识码:A文章编号:10043268(2010)09001705AgrobacteriumtumefaciensmediatedAntisensejQd21GeneTransfertoCotyledonaryNodeCellsofSoybean(GlycinemaxL.)ZHOUYanqing,LIUYanju,LIMin,DUANHongying,ZHOUChune,WANGfang,YUANBa

3、ojun(1.CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China;2.ZhoukouAcademyofAgriculturalSciences,Zhoukou466001,China)Abstract:Soybeanisthemostimportantoilcropintheworld.知一】isamajorgenerelatedtosoybeanoilcomponents.Inthepresentstudy,anefficientgenetransfersystemwasestablishedtotransferA

4、grobacteriumtumefaciensmediatedantisensead21geneintocotyledonarynodecellsofsoybean.ExperimentalfactorsconsideringinthesystemincludedAgrobacteriumtumefafien5concentration,precultureduration,COculturetime,recoverculturetime,PHvalue,acetosyringone(AS)ontheclustershootformationfrominfectedsoybeancotyled

5、onarynodeexplantswithAgrobacteriumturnefaciens.Withthissystem,kanamycinresistantregeneratedsoybeanplantswereobtained.Theintegrationofantisense一】geneintothesoybeangenomewasconfirmedbyPCR,PCRSouthernblotting,andGCanalysisindicatedthatthe一jgeneinthesoybeangenomewassuppressedbytheincorporatedantisenseon

6、e.Theseedoleiccontentoftransforreedsoybeanwas14.44%higherthanthereceptorline,whilethelinoleiccontentwas20.27lowerthanthereceptorline.Keywords:Glycinelna.2cL.;AgrobacteriurntumefacienS;Antisense一jgene;Genetictransformation;Antisensesuppression大豆(GlycinemaxL.)是重要的油料,食用和饲料作物,其主要用途之一是压榨大豆油,大豆油用量占全世界食用油的

7、311.大豆油9O是脂肪酸,包括硬脂酸,棕榈酸等饱和脂肪酸和油酸,亚油酸与亚麻酸等不饱和脂肪酸.脂肪酸的组成和配比种类决定植物油的品质.由于不饱和脂肪酸存在较多,使大豆油的保存期缩短.因此,大豆油往往要经过部分氢化,以减少多不饱和脂肪酸的含量.收稿日期:2010一O427基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10010415);河南省教育厅自然科学基础研究项目(2008A208018)作者简介:周延清(1963一),男,河南邓州人,教授,博士,主要从事遗传学教学和研究工作.*为通讯作者.Email:yqzhouhtu ?17?2O10年第9期在此过程中,自然形成的双键

8、变成反式构象,这种反式不饱和脂肪酸是引起冠心病的主要因素之一.所以,使大豆天然合成单不饱和脂肪酸,尤其是油酸,是解决以上问题的最佳途径之一.迄今,提高大豆油酸含量的育种技术有杂交育种,诱变育种和基因工程育种等.其中,抑制或降低催化油酸转化成亚油酸的关键酶大豆油酸脱饱和酶基因表达的技术,是提高大豆油中的油酸含量的有效的技术之一.采用该技术,Kinney于1996年培育出了油酸占总油脂86的大豆.美国杜邦公司于1997年获美国食品药物管理局批准,推广高油酸(占总油脂70)转基因大豆.2002年,Marillia等将一脂肪酸脱氢酶和延长酶FAE1基因转入大豆中,获得高油酸的转基因植株.日本也批准转基

9、因高油酸大豆成为食品.2008年,Wang等报道,利用RNAi技术抑制大豆GmFAD2基因,获得了几个平均油酸含量为71.581.9的高油酸大豆品系.吴永美等_8把含转录因子锌指蛋白的基因转入大豆幼胚,特异抑制了一j基因,获得该基因表达量减少7O95%,油酸含量提高24.5倍的大豆体细胞胚.2004年,河南师范大学生命科学学院植物分子遗传实验室从大豆基因组DNA中克隆了大豆油酸脱饱和酶基因一j,并构建了它的反义植物表达载体和根癌农杆菌工程菌.随后,陈喜风等从大豆RNA克隆出基因并构建其植物表达载体.本研究利用根癌农杆菌法将反义一j基因转入大豆子叶节,旨在为高油酸大豆的培育和转化体系的优化提供帮

10、助.l材料和方法1.1材料大豆品种JJBZ种子和转反义一j基因根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404工程菌(其中含CaMV35S启动子基因,NPT基因和反义一】基因的P4重组质粒)由河南师范大学生命科学学院植物分子遗传实验室自制.1.2方法1.2.1大豆子叶节遗传转化将发芽无菌苗子叶节外植体切下,在离子叶节3mm左右处切去下胚轴,然后在2个子叶中间将下胚轴纵向切开,去掉顶芽及侧芽,用解剖刀在子叶与下胚轴交接处3mm范围内划适当深度的切口,使每个无菌苗可产生2个用于转化的子叶节外植体.外植体放人预培养培养基(MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂,pH5.8

11、)中黑暗条件下预培养后,用含有反义一j基因的?】8?根癌农杆菌LBA44O4侵染.将吸去菌液的外植体放于含有卡那霉素分化培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L6BA+0.05mg/LIBA+50mg/I卡那霉素+500mg/L头孢氨苄+6.5g/L琼脂,pH5.8)中培养,长出不定芽后,进行继代培养.然后,将芽放在生根培养基(MS+30g/L蔗糖+0.2mg/L6BA+1.0mg/LIBA+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢氨苄+6.5g/L琼脂)上进行生根培养,待根系发育良好后,移栽到花盆中培养.从菌液OD值,预培养时间,侵染和共培养时间,乙酰丁香酮(AS)浓度和pH值方面,对农

12、杆菌介导的大豆转化体系条件进行筛选,具体设计如下:根癌农杆菌菌液设置了OD.值为0.30,0.50,0.6O,0.70,0.79,0.82和0.98的7个处理.外植体预培养设置了预培养0,1,2,3,4d5个处理.感染和共培养时间设置了4,8,12,16,2O,30min5个感染时间和1,2,3,4,5d5个共培养时间处理,每个处理5O个外植体.恢复培养时间设0,l,3,5,7d5个处理,每个处理5O个外植体.培养基为:MS+30g/L蔗糖十0.5mg/L6一BA+0.05mg/LIBA+500mg/L头孢氨苄+6.5g/L琼脂,pH5.8.AS浓度和pH值均设置5个处理,AS浓度分别为0,5

13、0,100,200,400.mol/L,PH值分别为5.2,5.4,5.6,5.8和6.0.丛生芽诱导率一(分化芽的外植体数/总外植体数)×l0O.1.2.2再生植株的CaMV35S启动子的PCR扩增及电泳检测用CTAB法从大豆叶片中提取DNA,用碱解法从转反义大豆d基因根癌农杆菌LBA4404工程菌中提取含CaMV35S启动子的重组质粒.参考郭兆奎等】的35S启动子碱基序列,设计了特异的PCR扩增引物.正向序列:5GCTCCTACAAATGCCATCA一3,反向序列:5,_GATAGTGGGATTGTGCGTCA一3.以重组质粒DNA作阳性对照,非转化大豆植株叶片基因组DNA作阴性

14、对照,对具有抗性并移栽成活的转反义fadej大豆再生植株进行PCR鉴定.1.2.3PCRSouthernblotting检测分别以重组质粒DNA(阳性对照),非转化大豆基因组DNA(阴性对照),PCR初步确定的转基因大豆基因组DNA为模板,用CaMV35S启动子的正向序列和大豆.一j基因的反向序列(5r_TTTTTGTCGACACTAGGCATGGGTCTAGC一3)为引物进行PCR扩增.然后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和PCRSouthernbloting分析.从凝胶中回收河南农业科学其为模板,采用随机引物法制备地高辛标记探针.用PCR扩增CaMV35S启动子(195bp)与反义.一J基

15、因(1196bp)的融合基因(1391bp),PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,转移到尼龙膜上,通过预杂交,杂交后一7O放射自显影7d,冲洗X光胶片.1.2.4转基因大豆种子油酸含量测定将转基因大豆T1代种子和未转化大豆种子送至农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州),用GC法测定其油酸和亚油酸含量.2结果与分析2.1大豆根癌农杆菌遗传转化体系的优化2.1.1根癌农杆菌菌液浓度对大豆丛生芽诱导率的影响结果表明,()Db00值(反映菌液浓度)为0.70时丛生芽诱导率最大.ODb.值在0.6OO.79时,大豆丛生芽诱导率均在70以上,均可用于转化(表1).表1根癌农杆菌菌液浓度对大豆丛生芽诱导率的

16、影响菌液ODo.值大豆丛生芽诱导率/%0.300.500.600.700.790.820.989.15O.271.586.483.3.2外植体预培养时间对大豆转化频率的影响一般认为,外植体预培养有以下优点】:可使伤口周围或细胞得以修复,愈合过程中分泌的酚类物质诱导农杆菌的vir基因启动;可促进细胞的分裂,更容易整合外源DNA;在高渗培养基上进行外植体预培养还可以减少伤口处的或细胞伤流液,使细胞内或液泡变小并发生一定程度的质壁分离,使农杆菌易于接触伤口周围的细胞,从而提高转化率.本研究结果表明(图1),外植体预培养处理2d时,转化频率最高,明显高于未进行预培养的处理.图1外

17、植体预培养时间对大豆转化频率的影响2.1.3感染和共培养时间对大豆转化频率的影响农杆菌对外植体的感染时间长短直接影响到转化频率,感染时间过长导致外植体坏死,从而降低了TDNA向外植体的转移效率.共培养时间的长短也会影响到转化频率,共培养会造成外植体生长能力的减弱.本试验研究结果表明(图2),感染16rain,共培养2d时效果最佳.3530芝25懈20慧15÷<105O234兆培养时问/d图2共培养时间及感染时间对大豆转化频率的影响2.1.4恢复培养时间对大豆转化频率的影响共培养之后外植体的生长能力变弱,如果直接转移到筛选培养基上,会造成已经转化的细胞因对抗生素的抗性变弱

18、而死亡.恢复培养结果表明,恢复培养3d或5d时较好.2.1.5AS浓度和pH值对大豆转化频率的影响AS浓度和pH值是影响植物遗传转化的2个重要因子.AS的使用使许多难转化植物的农杆菌介导的转化频率大幅度提高,甚至使以前不能被农杆菌感染的植物可以通过农杆菌介导法进行.对共培养AS的浓度和pH值研究结果表明(图3),pH值为5.6,AS浓度为100gmol/L时,大豆转化频率最高.353025芝姜20萎1.5矗lO50口0uIBO1,】圉5OuNO1/I100umol/5.86.0培养基pH值图3共培养培养基pH值和AS浓度对大豆转化频率的影响?19?2010年第9期2.2大豆

19、转化植株再生与移栽共培养2d后,接种于含有50mg/L卡那霉素和300mg/L的头孢氨苄的不定芽诱导培养基上(图4),12d继代1次,待芽生长到3Cm时,转入生根培养基(图5,图6),待新根,新叶长出后,移栽到温室中生长(图7).本试验中,共获得51个抗性芽,10个抗性植株,移栽到花盆中后成活了7株.1.未分化芽的子叶节;2.分化芽的子叶节图4转化的大豆子叶节在分化培养基上培养15d的大豆抗性丛生芽?2O?图5转入生根培养基的大豆抗性芽图6生根培养基上生根的大豆抗性植株图7移栽的大豆转基因再生植株2.3转反义fad2一j大豆再生植株的分子检测2.3.1CaMV35S启动子的PCR检测结果见图8

20、.阳性对照和转化植株扩增出195bp的CaMV35S启动子条带,而空白对照,阴性对照和未转化植株则无目的条带出现,初步确定这些含有目的条带的抗性植株为转基因植株.M.100bpLadder;1.空白对照;2.阴性对照;36,8.转化植株;7.未转化植株;9.阳性对照图8大豆植株的CaMV35S启动子PCR电泳检测2.3.2PCRSouthernblotting鉴定对重组质粒DNA和转化植株1,6和7基因组DNA进行PCR扩增和PCRSouthernblotting鉴定.结果表明(图9),重组质粒DNA和转化植株l,6和7基因组DNA的PCR扩增产物与探针有杂交信号,即其中整合了目的基因,获得了

21、转反义.厂n一J基因的大豆植株.1,49.转化植株;2.重组质粒(阳性对照);3.未转化植株(阴性对照)图9转化大豆植株PCRSouthernblotting鉴定2.3.3转反义.一J基因大豆种子油酸,亚油酸含量GC测定表明,非转基因大豆种子的油酸和亚油酸含量分别为38.65mg/g和9O.04mg/g,转基因大豆种子的油酸和亚油酸含量分别为44.23mg/g和71.79mg/g.由此可见,转基因大豆种子的油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而其亚油酸含量却降低了2O.27%.3讨论高效大豆遗传转化体系是成功获得转基因大豆的重要基础.目前,转基因大豆研究中使用的遗传河南农业

22、科学转化系统主要有载体转化系统,基因直接导入的转化系统和种质转化系统.其中,载体转化系统中的农杆菌介导法因具有诸多优点1.而备受研究者的青睐.但是大豆是一种公认的农杆菌难以转化作物.农杆菌介导的转基因方法的转化效率受到多种因素的影响14-193.本研究对影响农杆菌转化大豆的农杆菌菌液浓度,预培养时间,共培养时间,恢复培养时间,AS浓度和pH值进行了筛选,建立了一套较高效的大豆转化体系,并利用该转化体系,获得了转反义fad2一j基因大豆植株.PCR和PCRSouthernblotting检测结果表明,反义fad21基因已整合到大豆基因组中.GC检测表明,转反义fade一1基因的大豆种子的油酸含量

23、提高,抑制了大豆内源fad2一j基因的表达.本研究将为培育高油酸大豆品种提供一定帮助.参考文献:12I-3456KimWS,KrishnanHB.Expressionofan11kDamethionine-richdeltazeinintransgenicsoybeanresultsintheformationoftwotypesofnovelproteinbodiesintransitionalcellssituatedbetweenthevasculartissueandstorageparenchymacelll-J.PlantBiotech,2004,2:199-210.Gunston

24、eFE,PollardM.VegetableoilswithfattyacidchangedbyplantbreedingorgeneticmodificationM.NewYork:Marce1Dekker,200lIThelenJJ,OhlroggeJB.Metabolicengineeringoffat-tyacidbiosynthesisinplantsl,J.MetabEng,2002,4:1221.KinneyAJ.DevelopmentofgeneticallyengineeredsoybeanoilsforfoodapplicationJ.FoodLipids,1996,3:2

25、73292.MarilliaElizabeth-France,GiblinEM,CovelloPS,eta1.TaylorexpressionofmeadowfoamDes5andFAE1genesinyeastandintransgenicsoybeansomaticembryos,andtheirrolesinfattyacidmodificationl,J.PlantPhysiologyandBiochemistry,2002,40:821-828.柯继.日批准转基因高油酸大豆成为食品J.大豆通报,2002(4):30.7WangGeliang,XuYinong.HypocotylbasedAgrobacteriummediatedtransformationofsoybean(Glycinemax)andapplicationforRNAinterferenceJ.PlantCeIlRep,2008,27:11771184.8吴永美,毛雪,王书建,等.转基因改良植物的营养价值I-J.生物工程