基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版课件

1、基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版基于基于RNA-seq技术的玉米技术的玉米CMS-C花药可变花药可变剪接和新转录本的研究剪接和新转录本的研究学学 生：生： 汪汪 生生 庆庆 指导教师：指导教师：曹曹 墨墨 菊菊 教授教授 学科专业：学科专业：生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学日日 期：期：2012 2012 年年 12 12 月月 内容内容文献综述文献综述1背景、目的及意义背景、目的及意义2材料与方法材料与方法3预期结果预期结果4进度安排进度安排5基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1 文献综述文献综述 玉米(Ze ma

2、ys L) 是我国主要的粮、经、饲三元作物，面积和总产均占非常重要的地位，很长时间内供不应求。提高玉米产量任重而道远。 玉米利用杂交优势来制种，如利用不育化育种不仅充分地持续地保持玉米的杂种优势而且还能节约劳动力成本。1.1 植物雄性不育植物雄性不育v 植物雄性不育是指植物在有性生殖过程中不能产生正常的花药、植物雄性不育是指植物在有性生殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的遗传现象，而其雌蕊正常可接受外来花粉进行花粉或雄配子的遗传现象，而其雌蕊正常可接受外来花粉进行受精结实。受精结实。v Jones (1924) 洋葱。洋葱。1944以后，以后， 在玉米、高粱、油菜、水稻、棉在玉米、高粱、

3、油菜、水稻、棉花等高等植物中也发现了雄性不育性，经过选育用于杂种一代花等高等植物中也发现了雄性不育性，经过选育用于杂种一代种子生产。种子生产。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版CMS生理生化生理生化1. 2 植物植物CMS败育机理的研究败育机理的研究1.2.1 CMS的生理生化研究的生理生化研究物质代谢物质代谢同工酶同工酶植物激素植物激素能量代谢能量代谢光合作用光合作用膜脂稳定性膜脂稳定性基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版 基因表达调控是植物发生雄性不育的重要影响因素。基因表达调控是植物发生雄性不育的重要影响因素。 Twell

4、 D等利用等利用cDNA差别显示等分子生物学方法，己鉴定出差别显示等分子生物学方法，己鉴定出花粉或花药特异基因。花粉或花药特异基因。 曹家树等用曹家树等用mRNA差别显示技术。差别显示技术。 Erickon等限制性内切酶酶切方法分析等限制性内切酶酶切方法分析pol胞质和胞质和cam胞质的胞质的mtDNA，杂种后代分析。，杂种后代分析。 袁美等利用袁美等利用Northen对波里马细胞质雄性不育三系线粒体对波里马细胞质雄性不育三系线粒体RNA检测，发现检测，发现3个探针个探针atp6、orf224和和orf222。 Leving S对玉米、对玉米、Kadowaki对水稻的对水稻的cpDNA酶切后电

5、泳未发酶切后电泳未发现不育系与保持系之间存在多态性。现不育系与保持系之间存在多态性。1.2.2 CMS的的分子水平研究分子水平研究基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1. 3 高通量测序（高通量测序（RNA-Seq ）技术）技术Brian T. WilhelmUgrappa Nagalakshminaturescience2008年年6月月目前新一代测序技术的代表有目前新一代测序技术的代表有Roche/454，Illumina/Solexa ，ABI/ SOLiD等等。Illumina/Solexa高通量测序具有读长短，通量高，覆盖度更高，定高通量测序具有读长短

6、，通量高，覆盖度更高，定量更准确，测序成本低量更准确，测序成本低、极高的精确度和极低的检测限极高的精确度和极低的检测限。应用到应用到DNA水平水平的全基因组测序、基因组重测序、宏基因组研究的全基因组测序、基因组重测序、宏基因组研究等；等；RNA水平水平的转录组测序和小分子的转录组测序和小分子RNA 测序；测序；表观基因组学表观基因组学的的转录因子结合位点测序、转录因子结合位点测序、DNA甲基化测序等诸多领域甲基化测序等诸多领域。1. 4 可变剪接可变剪接v 可变剪接（可变剪接（Alternative splicing ，AS）是指一个前体）是指一个前体mR NA选择不同的剪接方式产生多种选择不

7、同的剪接方式产生多种mRNA剪接异构体的过程，是剪接异构体的过程，是基因调节和产生蛋白质多样性一个至关重要的机制。基因调节和产生蛋白质多样性一个至关重要的机制。v 调控可变剪接的因子主要有反式作用因子、顺式调控可变剪接的因子主要有反式作用因子、顺式 RNA 调节序列调节序列和其它和其它 RNA 特征（如外显子长度和特征（如外显子长度和 RNA 二级结构等）。二级结构等）。v 可变剪接的研究方法主要有可变剪接的研究方法主要有EST/cDNA技术法技术法 、基因芯片法基因芯片法以以及最近几年随高通量技术兴起的及最近几年随高通量技术兴起的高通量测序法。高通量测序法。基于基于RNAseq技术的玉技术的

8、玉米米CMSC花药可变剪接花药可变剪接和新转录本的研究完成和新转录本的研究完成版版1.4.1 可变剪接类型可变剪接类型根据基因组上同一外显子区域根据基因组上同一外显子区域(exon region)所发生的不同可变剪接事件，可变所发生的不同可变剪接事件，可变剪接可划分为四种基本类型：剪接可划分为四种基本类型：5端可变剪接、端可变剪接、3端可变剪接，盒式可变剪接端可变剪接，盒式可变剪接（又称跳跃式可变剪接）以及内含子保留型可变剪接，如图（又称跳跃式可变剪接）以及内含子保留型可变剪接，如图1-1所示。所示。图图1-1 可变剪接事件的类型可变剪接事件的类型基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接

9、和新转录本的研究完成版在生物体内，主要存在在生物体内，主要存在7种可变剪接类型：种可变剪接类型：A）Exon skipping; B）Intron retention; C) Alterna tive 5 splice site; D) Alternative 3 splice site; E) Alternative first exon; F) Alternative last exon; G) Mutually exclusive exon. 图图1-2 七种可变剪接示意图七种可变剪接示意图基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1.4.2 中心法则与可变剪接

10、中心法则与可变剪接图图1-3 真核生物真核生物mRNA的形成的形成基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版图图 1-4 前体前体 mRNA 的构成性剪接和可变剪接事件的构成性剪接和可变剪接事件基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1.4.3 前体信使前体信使 RNA 的剪接过程的剪接过程图图1-5 剪接体的构成剪接体的构成及组装过程及组装过程基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1.4.4 可变剪接的调控机制可变剪接的调控机制 剪接调节因子：剪接特征区域、反式剪接调控因子、顺式剪接调控元件、mRNA空间结构

11、、无义介导的mRNA降解。 剪接调节信号：剪接调节因子结合RNA 特定序列。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版影响剪接体识别剪接位点的序列信号通过与剪接因子等影响剪接体识别剪接位点的序列信号通过与剪接因子等调控蛋白相结合对剪接起调控作用。其中：调控蛋白相结合对剪接起调控作用。其中：ESEs ：通常被：通常被 SR（Ser-Arg）蛋白家族成员结合。）蛋白家族成员结合。ISSs 和和 ESSs： 被核不均一核糖核蛋白（被核不均一核糖核蛋白（hnRNPs）结合。结合。ISEs 不如其他三类元件具有很好的特点。不如其他三类元件具有很好的特点。基于RNAseq技术的玉

12、米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版芯片技术：剪接连接点芯芯片技术：剪接连接点芯片技术和外显子芯片技术片技术和外显子芯片技术寡核苷酸探针固定在玻璃寡核苷酸探针固定在玻璃片，每组探针都和特定的片，每组探针都和特定的外显子或剪接位点对应，外显子或剪接位点对应，原理如图原理如图1-11EST就是一组就是一组cDNA序序列，具有高通量、快速列，具有高通量、快速等优点。有利于全基因等优点。有利于全基因组可变剪接的研究。原组可变剪接的研究。原理如图理如图1-10进行高通量测序原始进行高通量测序原始reads。比对到目的基因组后比对到目的基因组后发现可变剪接位点，发现可变剪接位点，分析剪接位点序列特

13、分析剪接位点序列特征。征。EST数据基因芯片高通量测序1.4.5 前体信使前体信使RNA可变剪接的研究方法可变剪接的研究方法三大方法三大方法基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版1. 5 新转录本新转录本 新转录本（Novel Transcript Unit，Novel TU）现有的数据库对转录本的注释不够全面，所以将具有基因就够模型的，在基因间区的转录本作为新转录本对待。 特定基因的PCR产物，并对该产物进行生物信息学分析，确定某个基因间区存在新转录本，以及通过蛋白质组学的研究发现新的转录本。但具有一定的局限性。 高通量测序技术测序产生的大规模的reads通过短

14、序列比对软件匹配到基因或者基因组发现新转录本已经成为现实。 目前新转录本的研究仅仅在预测和简单实验验证基础上。但通过高通量测序研究新转录本已经成为一种趋势。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版2 课题研究的目的及意义课题研究的目的及意义 基于玉米C48-2和N48-2 Illumina/Solexa测序纯化后的clear reads比对到B73发现C48-2和N48-2中存在上万个基因发生了可变剪接，存在上万个新转录本。2.1 课题研究课题研究目的及意义目的及意义1）高通量测序技术数据基础分析可变剪接调控机制和序）高通量测序技术数据基础分析可变剪接调控机制和序列

15、结构特征，优化调控模型，预测潜在的可变剪接现象列结构特征，优化调控模型，预测潜在的可变剪接现象2）研究可变剪接事件产生蛋白质多样性和细胞质雄性不）研究可变剪接事件产生蛋白质多样性和细胞质雄性不育之间的关系。育之间的关系。3）研究新转录本所编码的功能蛋白和细胞质雄性不育之）研究新转录本所编码的功能蛋白和细胞质雄性不育之间的关系。间的关系。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3 材料与方法材料与方法3.2.1 Illumina / Solexa技术测序流程技术测序流程3.1 材料材料不育系：不育系：C48-2保持系：保持系：N48-2参考基因组：参考基因组：B733

16、.2方法方法C48-2和和N48-2花药转录组测序，平台花药转录组测序，平台2G Illumina/ Solexa / Hiseq 2000基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.2.2 Clean Reads数据的获得数据的获得及信息分析及信息分析 某些原始序列带有某些原始序列带有adaptor序列，或含有少量低质量序列。首先序列，或含有少量低质量序列。首先经过一系列数据处理以去除杂质数据，得到经过一系列数据处理以去除杂质数据，得到Clean reads。 去除含去除含adaptor的的reads 去除去除N的比例大于的比例大于10%的的reads 去除低质量

17、去除低质量reads（质量值（质量值Q5的碱基数占整个的碱基数占整个read的的50以上）以上） 获得获得Clean reads基因表达注释、可变剪接、预测新转录本以及潜在新基因等信息基因表达注释、可变剪接、预测新转录本以及潜在新基因等信息分析（图分析（图3-2）。）。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版测序评估测序评估表达量表达量SOAPaligner/soap2clean-reads比对到比对到B73基因基因组和基因序列组和基因序列统计比例，获统计比例，获得对总体比对得对总体比对情况的认识。情况的认识。Audic S。Mortazavi的的RPKM法计算法计

18、算差异表达差异表达比对统计比对统计基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.3 可变剪接分析可变剪接分析3.3.1可变剪接算法可变剪接算法 软件软件“TopHat”鉴定转录本的剪接位点（鉴定转录本的剪接位点（junction site）。 然后，通过分析同一基因的所有剪接位点，找出各种可变剪接然后，通过分析同一基因的所有剪接位点，找出各种可变剪接事件。分析算法如下：事件。分析算法如下：基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.3.2 可变剪接序列特征与机制分析可变剪接序列特征与机制分析 根据以上可变剪接算法识别的剪接位点，从根据以上可

19、变剪接算法识别的剪接位点，从Maize GDP下载玉米下载玉米B73全基因组及基因序列。提取基因剪接位点全基因组及基因序列。提取基因剪接位点区域序列，用于可变剪接机制的分析。序列提取按照剪区域序列，用于可变剪接机制的分析。序列提取按照剪接方式有所不同。接方式有所不同。提取方法提取方法基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.3.3 可变剪接事件分析可变剪接事件分析 分别统计不育系分别统计不育系C48-2和保持系和保持系N48-2中发生了中发生了Exon Skipping、Intron Retention、Alternative 5 Splice Site和和Alt

20、ernative 3 Splice Site四种可变剪接事件的可变剪四种可变剪接事件的可变剪接数量及所涉及基因个数；接数量及所涉及基因个数； C48-2和和N48-2中特异发生可变剪接数量及所涉及基因个中特异发生可变剪接数量及所涉及基因个数，剪接方式及剪接位点；数，剪接方式及剪接位点； C48-2和和N48-2中共同发生可变剪接数量及所涉及基因个中共同发生可变剪接数量及所涉及基因个数，剪接方式及剪接位点；数，剪接方式及剪接位点； C48-2和和N48-2中可变剪接次数与基因长度之间的关系。中可变剪接次数与基因长度之间的关系。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3

21、.3.4 雄性不育相关可变剪接分析雄性不育相关可变剪接分析v选取差异表达（见选取差异表达（见3.2.4.3）的且在）的且在C48-2中特异发中特异发生可变剪接以及生可变剪接以及C48-2和和N48-2中发生了可变剪接但中发生了可变剪接但剪接位点不一致的基因，根据剪接后产生的转录本序剪接位点不一致的基因，根据剪接后产生的转录本序列做一下分析：列做一下分析：vBlast2GO软件软件GO功能注释和显著性富集分析。功能注释和显著性富集分析。vCOG数据库进行蛋白相邻类的聚簇蛋白质功能分类分数据库进行蛋白相邻类的聚簇蛋白质功能分类分析。析。vKEGG PATHWAY数据库进行代谢通路分析。数据库进行代

22、谢通路分析。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.4 新转录本分析新转录本分析v 潜在基因模型（潜在基因模型（gene model）中挑选出长度大于）中挑选出长度大于150bp，位，位于基因间区域（一个基因于基因间区域（一个基因3端下游端下游200bp到下一个基因到下一个基因5端上端上游游200bp之间的区域）的潜在基因模型作为候选的新转录本。之间的区域）的潜在基因模型作为候选的新转录本。v 从从Maize GDP数据库下载数据库下载B73全基因组和基因序列，提取满足全基因组和基因序列，提取满足条件的条件的NU外显子起始和终止位点的序列，组装成转录本。外显子起

23、始和终止位点的序列，组装成转录本。v 用用Augustus 软件来预测可能的编码蛋白新转录本。软件来预测可能的编码蛋白新转录本。并做并做KO和和GO分析，预测潜在的新基因。分析，预测潜在的新基因。v 选取在选取在C48-2中特异表达的新转录本结合预测的功能用于分析中特异表达的新转录本结合预测的功能用于分析新转录本和雄性不育之间的关系。新转录本和雄性不育之间的关系。基于RNAseq技术的玉米CMSC花药可变剪接和新转录本的研究完成版3.5 RT-PCR验证新转录本和可变剪接验证新转录本和可变剪接v将将C48-2，N48-2和和B73统一播种与温江农场，在抽统一播种与温江农场，在抽穗期前后镜检，判断小孢子发育的时期。收集处于花粉穗期前后镜检，判断小孢子发育的时期。收集处于花粉母细胞、四分体、单核期、双核期的花药，用母细胞、四分体、单核期、双核期的花药，用Trizol提取花药总提取花药总RNA。v以提取检测合格的以提取检测合格的RNA作为模板，采用作为模板，采用TakaRa China按照其操作说明进行按照其操作说明进行cDNA第一链的合成。第一链的合成。v利用制备的利用制备的 cDNA 进行进行 RT-PCR扩增，以验证可变扩增，以验证可变剪接的分析结果。剪接的