暨南大学基因工程原理(DNA-蛋白质)

1、DNA-蛋白蛋白质相互作用质相互作用研究技术研究技术一一.酵母单杂交实验酵母单杂交实验 酵母单杂交方法(Yeast One-hybrid method) 是根据DNA 结合蛋白(即转录转录因因子子) 与DNA 顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因(cDNA)。该方法也是在细胞内 分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter , Pmin) 上游,Pmin 启动子下游连接报道基因。进行cDNA 融合表达文库筛选时,编码目的转录因子的cDNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后,其编码产物(转

2、录因子) 与顺式作用元件结合,就可以激活Pmin 启动子,并促使报道基因表达。根据报道基因的表达,筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 以DREB 转录因子基因(cDNA) 的克隆为例,介绍如何应用酵母单杂交方法来获得编码特定转录因子的cDNA ,并验证它与特定的顺式作用元件的结合。1.cDNA AD 融合表达文库( cDNA AD fusion library) 的构建 应用酵母单杂交方法筛选编码特定转录因子的cDNA ,首先要构建cDNA AD 融合表达文库。AD 是激活区(activation domain) 的简写,一般常用GAL4 因子。为了有效地克隆某些特定的转录因子,如在干旱或低

3、温胁迫下调控植物相关耐性基因表达的转录因子,可将植物进行适当的干旱或低温处理,再提取mRNA。这样获得的mRNA 里,编码目的转录因子的基因的含量可以提高几倍至几百倍。对于某些正常情况下不表达的基因,必须经过一些特定处理诱导其表达,才有可能克隆到它们所编码的转录因子。 将分离提纯的mRNA 合成cDNA ,两端接上带有合适酶切位点的连接物(adaptor) ,构建到融合表达载体中GAL4 AD 下游的多克隆位点(图2A) 。然后,进行噬菌体包装(packaging) ,在XL21 细胞内进行自动剪接环化,最后提取cDNA质粒用于筛选。2 酵母报道子(Yeast reporter) 的构建 -

4、顺式元件- Pmin -报道基因-2.1顺式元件重复序列的构建为了提高筛选的效率(即转录因子与顺式元件的识别率),需要在Pmin启动子上游构建3个或3个以上的顺式元件的重复序列。图2B列出的4个DRE元件重复序列的连接方法如下:合成两个DNA引物,末端设计有Hind酶切位点,通过PCR,从rd29A基因的启动子中合成含有一个DRE元件的75bp的DNA片段(在顺式元件上游留出约50bp的碱基,这段序列有助于转录因子与顺式元件的结合)。用Hind限制性内切酶处理75bp的DNA片段,使其两末端露出Hind的连接位点。该DNA片段的序列如下(划线部分为DRE元件):52AGCT2TACATCAGT

5、TTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAAT2AAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAA2GCA23。用T4连接酶连接上述DNA片段。连接反应是随机的,大部分只连接成两个DRE重复的片段,即2DRE2DRE2,少数可以连接成三个DRE重复的片段2DRE2DRE2DRE2或四个DRE重复的片段2DRE2DRE2DRE2DRE2(机率约为2%)。将连接后的DRE重复片段构建插入pBluescriptSK+载体的Hind位点,通过测序确定含有4个DRE重复片段及其5末端和3末端方向的一致性后,用EcoR和Hinc酶将4个DRE重复片段从pBluescrip

6、tSK+载体上切除,得到这样的DNA片段:52GAATTC2DRE2DRE2DRE2DRE2GTCGAC23(5端为EcoR位点,3端为Hinc位点)。 2.2 表达载体的构建酵母单杂交中报道子的构建,可采用pHISi21和pLacZi表达载体.pHISi21载体含有最基本启动子PminHIS3和组氨酸报道基因HIS3,在PminHIS3上游插入顺式元件并转化入酵母后,一旦目的转录因子结合到顺式元件,激活PminHIS3启动子,就能促使HIS基因转录表达,从而使酵母细胞在缺乏组氨酸的SD培养基(SDHis-)上能够生长,并产生对32AT(32aminotri2azole,剧毒物)的抗性。pLa

7、cZi载体则含有最基本启动子PCYC1和半乳糖苷酶报道基因LacZ,在PCYC1上游插入顺式元件并转化入酵母,当目的转录因子结合到顺式元件,激活PCYC1启动子,促使LacZ基因表达后,在ZX2gal溶液作用下,能使酵母细胞呈蓝色反应。同时,pLacZi载体也含有尿嘧啶报道基因URA3,因此,转化后的酵母也能在缺乏尿嘧啶的培养基(SDUra-)上生长。将含有4个重复DRE元件的串联序列52GAATTC2DRE2DRE2DRE2DRE2GTCGAC23分别构建到pHISi21载体的PminHIS3启动子和pLacZi载体PCYC1启动子上游,用Xho和Nco内切酶分别将pHISi21载体和pLa

8、cZi载体切成线状。先将线状pHISi21载体转化到酵母细胞内,获得能在SDHis-培养基上正常生长的酵母转化子。接着以这种酵母转化子为寄主细胞,继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SDHis-,Ura-培养基上,选择获得如图2B所示的含有pHISi21和pLac2Zi双重报道子的酵母转化子。3 .cDNA融合表达文库的筛选利用含有pHISi21和pLacZi双重报道子的酵母转化子来筛选cDNAAD融合表达文库。在构建文库时,cDNA是随机插入AD融合表达载体,即编码目的蛋白的cDNA片段可能正方向(sence)或反方向(antisence)插入进去

9、。此外,在提取mRNA时,难以避免5端个别碱基的分解,因此合成的cDNA如按正方向插入AD融合表达载体,只有三分之一的机率使cDNA保持正确的阅读框。cDNA也有可能反方向插入表达载体,这样造成cDNAAD融合表达文库中编码生成正确目的蛋白的机率为六分之一。如果以每种生物体含有10万个基因来计算,要获得1个真正的阳性克隆,就应筛选60万个酵母转化子。前面标题1文库构建中提到,在提取mRNA之前将植物进行适当处理(如干旱或低温等),可诱导编码目的转录因子mRNA的大量生成,使其含量增高,从而可以提高cDNA文库的筛选效率。如果通过特定处理使编码目的因子的mRNA生成量提高1020倍,筛选60万个

10、酵母转化子,就有可能获得1020个阳性克隆。除了酵母转化子中双重报道子含有的HIS3和URA3报道基因(图2B),cDNAAD融合表达载体pAD2GAL4本身还含有亮氨酸报道基因LEU2(图2A),因此,实际筛选在缺乏组氨酸、尿嘧啶和亮氨酸的SD培养基(SDHis-,Ura-,Leu-)上进行(图2C)。为了消除最基本启动子PminHIS3和PCYC1的本底,在培养基中加入10mmolL3AT,就可以很好地抑制假阳性克隆的生长。cDNAAD融合表达载体被转化进入酵母细胞后,其编码产物如果是目的转录因子,就可在酵母细胞内识别并结合到顺式作用元件上(如图2B的DRE元件),同时激活PminHIS3

11、和PCYC1启动子,使HIS3和LacZ基因表达,酵母细胞就能在含10mmolL3AT的SDHis-,Ura-,Leu-选择培养基上生长(图3)。将转化的酵母细胞涂布在选择培养基平板上,56天阳性菌落的直径可达2mm.4 阳性克隆的鉴定 通常采用3AT抗性检测与半乳糖苷酶活性检测两种方法来鉴定阳性克隆。取上述获得的阳性克隆菌落,充分悬浮于200lTE溶液,涂布于含60mmolL3ATSDHis-,Ura-,Leu- 选择性培养基上,真正的阳性克隆能在这样的条件下生长。用硝酸纤维素膜覆盖生长在含60mmolL3AT的SDHis-,Ura-,Leu-选择性培养基上的菌落,通过印迹法将酵母菌转移到膜

12、上。将滤膜放入液氮中冰冻处理10秒钟,然后在室温让其自然融解。再将膜放入含有X2gal的Z缓冲液中,3030分钟,如果膜上的酵母菌变成蓝色,说明菌落是真正的阳性克隆.二.染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。 核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特

13、异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 该技术主要应用于： 1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记” 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损失与凋亡分析ChIP最初用来分析乙酰化组蛋白和特定DNA序列相互作用在DNA转录中的作用，近来该方法更多用于研究特定DNA序列和转录因子的相互作用。该技术能反映生理状态下细胞核内DNA的功能。该方法基本流程：细胞和交连剂甲醛孵育，以防止在后续步骤中蛋白和DNA分离；2.将DNA超声破碎成片段，然后离心去除不溶性的细胞碎片；3.上清中加入一抗，然

14、后用protein A/G-琼脂糖凝胶捕获抗原抗体复合物。4. 用含有不同盐和去污剂的缓冲液洗涤几次；5. 用洗脱缓冲液洗脱抗原抗体复合物；6. 消化该免疫复合物；7. 乙醇沉淀分离DNA；8.用southern(放射性物质或地高辛标记) 或PCR方法分析DNA。 三.DNA-蛋白质相互作用研究技术的新进展 随着分子生物学和生物技术的迅猛发展,传统的生物化学和物理化学研究方法已不能满足现有的实验要求,分子生化学家们力求建立和发展更为有效、灵敏、快速和精确的鉴定DNA-蛋白质相互作用的方法。核酸适体技术、荧光技术、扫描探针显微镜技术、等离子共振技术、质谱技术和分子模拟等先进手段应运而生,并促进该

15、研究领域沿微观方面进军。 1 SELEX与核酸适体技术 用于DNA-蛋白质相互作用研究的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是一种新型的体外筛选技术,它以DNA与蛋白质相互作用为基础建立随机寡核苷酸文库,从中筛选到能与各种配体(靶蛋白)特异性结合的单链寡聚核苷酸片段,长度一般为2040bp,该寡核苷酸片段就称为核酸适体(aptamer)。其筛选过程包括:(1)体外合成含10131015个单链寡核苷酸序列的随机文库;(2)在适宜条件下,孵育单链寡核苷酸库与靶蛋白形成DNA-蛋白质复合

16、物;(3)分离未与靶蛋白结合的寡核苷酸;(4)解离与靶蛋白结合的寡核苷酸,以此为模板进行PCR扩增,得到特异结合的寡核苷酸库,再进行下轮的筛选过程;(5)通过反复筛选与扩增,得到亲合力强于抗原抗体之间的高特异核酸适体。SELEX技术至问世来就以惊人的速度发展,因其库容量大、特异性高、亲和力强等优点,在靶物质的筛选上得到了广泛应用,也为DNA-蛋白质相互作用研究提供了一种新颖的研究方法。 2 荧光技术 该技术已广泛用于生物分子之间的相互作用研究。由于核酸及其链上的碱基的荧光产率很低,蛋白质组成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然荧光,所以采用/内源荧光0的分析方法受到了很大的限制。用于研究DN

17、A-蛋白质相互作用的荧光法,主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的检测技术。它对待测物质的浓度要求低,灵敏度高且部分荧光技术可实现对待测物质的动态分析等,基于这些优点,在短短的几年内得到了迅速发展。 激光诱导荧光(Laser Induced Fluorescence,LIF)技术是常用的荧光技术之一,其灵敏度非常高,浓度检出可达到10-13molPL,对于某些荧光效率高的物质甚至可达单分子探测水平,且检测时间短、样品需要量少、可在线检测等优点。目前,LIF常与毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)连用形成毛细管电

18、泳联合激光诱导荧光技术CE-LIF,该技术成为生物、化学、医学等高灵敏检测领域的首选技术之一。 单分子光谱是研究分子间非共价键作用的一种有效工具,它可实现分子探测的极限。人们通过对运动分子的动力学和单分子的光谱性质进行测量,从而实时监测生物分子之间相互作用的途径和机理,为蛋白质与核酸的相互作用研究提供许多新机会。目前,单分子检测技术已实现了对DNA转录的早期阶段进行直接成像研究,相信不久人们便能观察到包括转录终止在内的DNA转录的全过程。 量子点(quantum dots, QDs)是近年来发现的一种新型荧光标记物,是有族元素或族元素组成的小于100nm的半导体纳米微晶体,如CdSe、CdS、

19、CdTe、CdSePZnS、CdSePZnSe和CdSPZnS等。它具有一个很宽的连续的激发光谱和窄而对称的发射光谱,且光化学稳定性良好、可溶与水、对细胞和生物体无毒性等特点,已成为理想的荧光探针材料,在生命科学诸多领域中展现了广阔的应用前景。武汉大学的庞代文等在量子点的细胞标记和成像研究方面取得了突破性进展,他们用CdSePZnS核壳结构量子点标记的羧甲基壳聚糖作为探针用于酵母活细胞成像,同时研制荧光和磁敏双功能纳米球并共价偶联免疫球蛋白、抗生物素蛋白等,形成新的具有荧光-磁性-生物靶向的三功能纳米球。目前,关于QDs的报道大部分集中于荧光探针的识别和活体成像方面的应用,基于QDs的荧光猝灭

20、或增敏的荧光传感技术也迅速发展这些工作都证实了荧光技术对快速、深入研究DNA-蛋白质相互作用具有十分重要的意义。量子点不同大小的CdSe量子点暴露在紫外光下会发出不同颜色的荧光3 扫描探针显微镜技术 扫描探针显微镜(scanning probe microscope,SPM)是扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope, STM)、原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)、扫描近场光学显微镜(scanningnear-field optical microscope, SNOM)、弹道电子发射显微镜(ballistic elect

21、ron emission microscope, BEEM)、扫描力显微镜(scanning force microscope, SFM)等一系列仪器的总称.它利用探针尖端与样品分子间的相互作用对生物分子进行成像,并以原子或分子分辨率探测生理环境下的生物表面力,所以通过该技术可观察单个原子层的局部表面结构,得到直观的表面三维图像和相关的表面结构的信息,亦可以在生理条件下连续观察生物样品,了解某些生命活动的动态过程。其中,原子力显微镜(AFM)在研究DNA-蛋白质的相互作用方面有着较广泛的应用,它能对每一个DNA、蛋白分子以及DNA-蛋白质复合体分别观察并进行定性和定量分析,提供更多真实直观的信

22、息。 SPM作为一种崭新的技术手段,在研究DNA-蛋白质相互作用的领域起到越来越重要的作用,但尚存在一些不足,如SPM扫描速度过低,满足不了细胞内的分子反应速度;体外实验能否真实反应细胞内的生化反应过程,固定表面的存在对DNA-蛋白质反应会产生哪些影响等问题尚未清楚。近年来,我们不断完善此技术,取得一些可喜的成绩30,如更精细的半径可达0.15nm的碳纳米管针尖、短而软的悬臂实现快速扫描、微悬臂阵列等。相信随着SPM仪器的完善和样品处理技术的提高,以接近细胞内反应的时间分辨率追踪细胞内的调控反应也指日可待。 DA Erie等用AFM观察了K噬菌体Cro蛋白与双链DNA结合的图像,分析了Cro蛋

23、白结合到DNA上靶位点和非靶位点引起的DNA弯曲,指出Cro蛋白很可能是以一维扩散方式沿DNA搜寻靶位点;Gi Hun Seong等用AFM技术观察了核蛋白质RecA与DNA的相互作用及其作用位点;S. John T. Van Noort等29用AFM观察了光解酶和DNA分子在液体中的动态成像,并对DNA、蛋白分子的三维大小及结合引起DNA的弯曲角进行了定量分析,发现光解酶分子非特异性结合到DNA分子上,并且沿DNA移动。 4 生物质谱技术和表面等离子共振技术 生物质谱技术采用先进的软电离技术使过去主要用于小分子研究的质谱技术发生了重大变革,它主要包括电喷雾质谱(electrospray ionization