实验简单染色法

1、实验三 细菌的简单染色目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。握细菌的简单染色法。2. 初步认识细菌的形态特征。初步认识细菌的形态特征。3. 学习显微镜（油镜）的使用方法，熟悉学习显微镜（油镜）的使用方法，熟悉无菌操作技术。无菌操作技术。 简单染色简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。：利用单一染料对菌体进行染色。 染料是一类苯环上带有染料是一类苯环上带有发色基团发色基团和和助色基助色基团团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征，的有机化合物。前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。后者使染料能形成盐。 常用的微生物细胞染料都是盐，分

2、酸性染常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。及刚果红属于酸性染料。v在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。其着色。v细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产细胞处于酸性条件下（如

3、细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。染色。微生物染色原理微生物染色原理材材 料料1. 菌种菌种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2. 染色剂染色剂 3. 仪器或其他用具：仪器或其他用具： 显微镜显微镜 酒精灯酒精灯 载玻片载玻片 接种环接种环 香柏油香柏油 二甲苯二甲苯 擦镜纸擦镜纸 生理盐水等。生理盐水等。涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗镜检镜检简单染色方法简单染色方法干燥干燥作业作业 实验报告实验报告（结果部分：绘图说明金黄色葡萄球菌和枯草芽（结果部分：绘图说明金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的形态特征，注明

4、观察时使用的物镜及孢杆菌的形态特征，注明观察时使用的物镜及放大倍数）放大倍数）下一个实验：革兰氏染色法下一个实验：革兰氏染色法1、涂片、涂片1.取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水；滴一小滴生理盐水；2.用接种环用接种环无菌操作无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌从琼脂斜面上挑取适量菌苔；苔；3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。匀并涂成薄膜。注意：注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。不宜过多；涂片要涂抹均匀，不

5、宜过厚。2、干燥、干燥v 将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。干燥。也可用电吹风低温吹干。3、固定、固定v手持手持( (木夹夹住木夹夹住) )已干燥的涂有菌膜的载玻片，已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2 23 3次。次。原理：原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。注意：注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。坏细胞形态

6、。4、染色、染色v将将热固定的细菌热固定的细菌涂片平放于在载玻片架涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。涂片薄膜为宜）。v染色时间：染色时间：吕氏碱性美蓝染色吕氏碱性美蓝染色12min；石炭酸复红染色约石炭酸复红染色约1min草酸铵结晶紫染色约草酸铵结晶紫染色约1min。5、水洗、水洗v将将细菌细菌涂片上染液倒入废液缸中；涂片上染液倒入废液缸中；v手持手持细菌染色细菌染色涂片，置于废液缸上方，涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。水无色为止。注意：注意：水洗时，不要

7、直接冲洗涂面，而应水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。急，过大，以免涂片薄膜脱落。6、干燥、干燥v自然干燥：自然干燥：平放于室温，自然干燥；平放于室温，自然干燥；v吹干：吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；用电吹风冷风或低温热风吹干；v吸干：吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。7、镜检、镜检 涂片干后镜检。涂片干后镜检。 防止水的折射，以便于观察。防止水的折射，以便于观察。显微镜的基本结构（P41）1. 物镜转

8、换器物镜转换器 2. 物镜物镜 3.标本夹标本夹 4.载物台载物台 5.聚光器聚光器 6. 彩虹光圈彩虹光圈 7.光源光源 8. 镜座镜座 9. 电源开关电源开关 10. 光源滑动变阻器光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋（粗调节器）粗调螺旋（粗调节器） 12. 微调螺旋（细调节器）微调螺旋（细调节器）13. 镜臂镜臂14.镜筒镜筒 15.目镜目镜 16.玻片夹推进器玻片夹推进器显微镜使用操作步骤1、观察前的准备观察前的准备2 2、显微镜观察显微镜观察3、显微镜使用完毕后的处理显微镜使用完毕后的处理1、观察前的准备v仔细阅读显微镜使用说明书仔细阅读显微镜使用说明书v取镜（一手握镜臂，一手托底座）取

9、镜（一手握镜臂，一手托底座）v显微镜的放置（平放，距边缘约显微镜的放置（平放，距边缘约10cm10cm）v熟悉显微镜，检查显微镜熟悉显微镜，检查显微镜v调节光源（光线均匀，亮度适宜）调节光源（光线均匀，亮度适宜）v调节双筒显微镜的目镜调节双筒显微镜的目镜v调节聚光器数值孔径调节聚光器数值孔径v检查显微镜物镜、目镜、聚光器检查显微镜物镜、目镜、聚光器2、显微观察观察程序如下：观察程序如下：v放置观察标本放置观察标本v低倍镜观察低倍镜观察v高倍镜观察高倍镜观察v油镜观察油镜观察v 将标本玻片置于载物台上将标本玻片置于载物台上( (注意标本朝上注意标本朝上) )，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处

10、用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处于物镜的正下方。于物镜的正下方。放置观察标本v 下降低倍物镜，从侧面注视调节，使其接近标下降低倍物镜，从侧面注视调节，使其接近标本。本。v 双眼看目镜，慢慢旋转粗调节螺旋使镜筒缓慢双眼看目镜，慢慢旋转粗调节螺旋使镜筒缓慢升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。v 慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位，慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位，置于视野中心，观察、记录结果，并准备换高置于视野中心，观察、记录结果，并准备换高倍镜观察。倍镜观

11、察。低倍镜观察v将高倍物镜转至镜筒下方将高倍物镜转至镜筒下方 ( (在转换物镜时，要在转换物镜时，要从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞头与玻片相撞) ) 。v调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，移转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，移动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。 高倍镜观察物镜的同焦现象（物镜的同焦现象（P44）v用粗调螺旋将镜筒上升，转动转换器将油镜转至用粗调螺旋将镜筒上升，转动转换器将油镜转至镜

12、筒正下方。镜筒正下方。v在标本镜检部位滴上一滴香柏油。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。v从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心下降镜筒，从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心下降镜筒，使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止( (注意注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头) )。v调节聚光器及照明后，眼看目镜，微微转动粗调调节聚光器及照明后，眼看目镜，微微转动粗调螺旋将镜筒上升，当视野中有模糊的标本物象时，螺旋将镜筒上升，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为改用细调螺旋，并移动标本直至

13、标本物象清晰为止。止。油镜观察油镜的工作原理（P42）1 1、增加照明亮度增加照明亮度2 2、增加显微镜的分辨率增加显微镜的分辨率1、增加照明亮度v使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。油质，称为油浸系。v如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系。燥系。v一些物质的折射率：一些物质的折射率： 水水 1.33 玻璃玻璃 1.52 空气空气 1.0 香柏油香柏油 1.5152、增加显微镜的分辨率v分辨率分辨率（分辨力

14、）是指显微镜能辨别物体两（分辨力）是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。点间最小距离的能力。 式中式中 =光波波长光波波长v数值孔径数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度，即光线投射到物镜上的最大角度( (称镜口角称镜口角) )的一半正弦，乘上玻片与物镜间的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：其中其中2sinnAN最大入射角，即镜口角介质折射率nAN 2能辨别两点间最小距离v香柏油的折射率大于空气和水，因此，它作介质香柏油的折射率大于空气和水，因此，它作介质时，数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。时，数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。v数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小，数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小，即分辨率越高。即分辨率越高。 v观察完毕，上升镜筒，取下标本片。观察完毕，上升镜筒，取下标本片。v先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜