实验五分光光法测定血清蛋白含量

1、分光光度法分光光度法测定血清蛋测定血清蛋白含量白含量实验目的 1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3.掌握紫外-可见分光光度计的使用方法。常识紫外光：10-400nm；可见光：400-780nm（可被人们的眼睛所感觉）;自760nm至400m的电磁波称为红外线，红外线是不可见光线实验原理 紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。定性分析：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.定量分析：常采用标准曲线法，即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横

2、坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。方法一：标准曲线法原理 蛋白质分子中存在着含有共轭双键的络氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，使蛋白质在270290nm波长范围内具有吸收紫外光的性质，其蛋白质溶液的吸收值与其浓度成正比，以此可做定量分析测定。方法 测定一系列浓度不同的标准溶液的吸光度， 以吸光度为纵坐标，标准溶液（蛋白质溶液）浓度为横坐标绘制出280nm出血清蛋白质的标准曲线， 再以相同条件下处理待测样品并测定其吸光度，从而可以从标准曲线上查出相对应的待测液溶度。 试剂：0.15mol/LNacl溶液、蛋白质标准溶液、蛋白质待测溶液 器材：紫外分光光度计

3、、石英比色杯、试管架、试管、吸管、洗耳球、记号笔实验步骤取9支试管，分别用记号笔表上1-8和U（待测）数字；按照下表格加入试剂 混匀，选用石英比色杯，在280nm处以第一管调节零点，记录比色结果。 制作标准曲线，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制出280nm处的血清蛋白质标准曲线 根据标准曲线查出所测蛋白质浓度电脑绘制标准曲线图方法新建一个EXCEL，一行输吸光度，一行输标准系列的含量，用鼠标选定这两行，点击菜单栏的“插入”，选择“图标”（或直接点工具栏的“图表向导”），在弹出的对话框里点“X-Y散点图”，点击完成选择在出现的图标上任意一个点，在这个点上点击右键，在弹出的对话框里点击“

4、添加趋势线”，在弹出的“添加趋势线”对话框里点击“选项”那一页，选取“显示公式”“显示R2”，点击完成后，再看你的图，标准曲线及公式就出来了方法二原理 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸含有共轭双键，可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处. （1）Lowry-Kalcker公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （2）Warburg-Christian公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260实验用品

5、 （一）器材 试管，移液枪，紫外分光光度计。 （二）试剂 10.15mol/LNaCl溶液，用蒸馏水定容。 2被检血清。实验内容 用0.15mol/LNaCl溶液将血清作100倍稀释，选用光径为1cm的石英比色杯，分别在280nm和260nm波长两处测定溶液的吸光度（A），根据Lowry-Kalckar公式或Warburg-Christian公式计算此溶液的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数100得到血清蛋白质的真实浓度。方法三原理Waddel公式： 蛋白质浓度（g/L）=144（A215-A225） 由于血清中不同类型蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，所以测定270nm290nm波段紫外吸收也会因每个

6、样品中蛋白质氨基酸组成的差异而有较大的变异，因而这个方法不能直接用于血清总蛋白质的准确定量。而在远紫外区（200nm225nm）的光吸收主要由肽键所致，各种蛋白质具有相同的吸收系数。实验用品 （一）器材 试管，移液枪，紫外分光光度计。 （二）试剂 10.15mol/LNaCl溶液，用蒸馏水定容。 2被检血清。 Waddel公式法用0.15mol/LNaCl溶液将血清作1000倍稀释，选用光径为lcm的石英比色杯，分别在215nm和225nm波长两处测定溶液的吸光度（A），根据waddel公式计算此溶液的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数1000得到血清蛋白质的真实浓度。作业 计算 按前述三种方法计算血

7、清蛋白质浓度，方法一中附上标准曲线图。【注意事项】 1270nm290nm紫外法对测定蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质溶液，有一定的误差。 2本法需用高质量石英比色杯，因玻璃可吸收紫外线。 3紫外分光光度计使用前需对其波长进行校正。 4样液的蛋白质浓度控制在1525g/L范围内。 5注意溶液pH值，这是由于蛋白质的紫外吸收峰会随pH的改变而变化。 6受非蛋白质因素的干扰严重，除核酸外，游离的色氨酸、酪氨酸、尿酸、核苷酸、嘌呤、嘧啶和胆红素等均有干扰。导致测量误差的几点因素 分三点：化学因素光学因素主观因素 1、化学因素：化学因素是指被测溶液不遵守光吸收定律所引起的误差。主要有： 被测物浓度的影响；溶液PH的影响；杂志的影响；放置时间的影响；此外，还有溶剂，温度，以及溶液体系的均匀性等都会引起测定的误差。 2、光学因素：光学因素主要是由分